轉基因(transgene)是指將人工分離和修飾過的外源或內源基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體性狀的可遺傳修飾。生物體內染色體復制的過程中，兩條染色體之間會發生同源重組，這一現象為轉基因的實現提供了可能。然而同源重組會導致染色體缺失、異位和基因失活等不利于轉基因哺乳動物生物學效應的穩定遺傳。早在20世紀40年代，美國遺傳學家McClintockB在研究玉米的遺傳因子時發現，某些基因活性受到一些能在不同染色體間轉移的控制因子(controllingelement)所決定，這些控制因子就是轉座子。隨著對昆蟲的深入研究，已陸續發現一些可以用于哺乳動物轉基因研究的轉座子，它們分別是:piggyBac、hyperactiveSleepingBeauty(SB11)和Tol2［1］。在這三者中，piggyBac轉座子識別位點5'-TTAA-3'，剪切和插入不留下印跡，且轉座效率比其他兩個高。與同源重組相比，高效位點特異性整合的非病毒載體-piggyBac轉座子可能更有利于定點整合，此外，piggyBac轉座子還是研究基因功能的一個很好的工具。

1piggyBac轉座子的結構

來自粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的piggyBac轉座子全長2472bp，兩端為13bp的反向末端重復序列(ITR)和19bp的亞末端重復序列(subR)，5'反向末端重復序列(ITR)與亞末端重復序列(subR)之間有31bp，3'反向末端重復序列(ITR)與亞末端重復序列(subR)之間有3bp(圖1)［2］。piggyBac轉座子末端和亞末端重復序列都是活性自主轉座子必需的元件。在亞末端重復序列中有一個2.1kb的轉錄單位，其中有一個1.8kb的開放閱讀框(ORF)，這個轉錄單位編碼一個約64ku的轉座酶［3］。轉座酶介導piggyBac轉座子剪切和插入宿主基因組中，實現轉座。

2piggyBac轉座子的轉座

piggyBac轉座子發生轉座時，在轉座酶的作用下，精確地剪切和重新插入宿主基因組中。在哺乳動物細胞中，piggyBac轉座子表現出與在昆蟲研究中具有相似的特性。

2.1piggyBac轉座子的轉座特點

在哺乳動物轉基因過程中，外源基因在基因組中的定位，有利于分析陽性克隆細胞或生物體的基因功能及其生物學效應。然而，piggyBac轉座子在轉座酶的輔助下，特異性識別基因組中位點5'-TTAA-3'，并且在隨機插入基因組的過程中，更傾向于插入基因的5'非翻譯區［5］。外源基因插入宿主基因組的非編碼區，使外源基因在體內得到表達，與同源重組相比，piggyBac轉座子更有利于轉基因哺乳動物的產生。piggyBac轉座子在剪切和粘貼的過程中，會越過DNA的合成，而不影響到DNA的修復或復制。piggyBac轉座子上的DNA發生甲基化時，其轉座被抑制。在老鼠的胚胎肝細胞中，piggyBac轉座子跳躍的頻率比較高，載體系統在轉染細胞后，通過反向PCR和Southernblot技術，在一些陽性克隆細胞中，可以檢測到15個以上的拷貝數［4］。此外，piggy-Bac轉座子傾向于在局部范圍(≈100kb)內跳躍。

2.2piggyBac轉座子的轉座機制

轉座酶能夠識別轉座子的末端反向重復序列并且在其3'端切開，同時在轉座子的靶部位交錯切開單鏈，它的5'突出末端與轉座子的3'末端連接，形成Sharpin中間體。不同種類轉座子形成與靶序列連接中間體的過程大致相同;隨后步驟各不一樣。RupakMitra等［6］推斷piggyBac轉座子的轉座有4個步驟(圖2)。第一步:雙鏈斷裂，在轉座子3'末端與側翼供體DNA之間產生一個切口，在轉座子末端暴露具有活性的3'OH。第二步:3'OH作為一個親核基團，它與互補鏈上側翼供體DNA的4個核苷酸結合，在轉座子末端產生了一個發夾，同時轉座子從供體DNA上分離。側翼供體DNA包含互補的5'-TTAA，延伸能再結合修復供體缺口，從而產生一個精確的剪切。第三步:轉座酶破壞轉座子末端的發夾結構，在離體線性的轉座子的5'末端留下4個核苷酸的突出端，并且在轉座子的末端再一次暴露3'OH。第四步，轉座子末端的3'OH與靶位點的DNA共價連接。對piggyBac轉座子的轉座機制的了解，有利于更好的用于基礎和應用研究。

3影響piggyBac轉座子的轉座因素

3.1轉座酶

piggyBac轉座酶是DDE重組酶超家族中的一員，在載體系統轉染哺乳動物細胞中，轉座子載體和轉座酶載體之間劑量的不同會影響piggyBac轉座子的轉座效率。在一定劑量范圍內，當轉座子載體和轉座酶載體的劑量同時增加時，轉座子在宿主基因組的拷貝數會增加，然而，當增加轉座酶載體的劑量時，pig-gyBac轉座子發生轉座的頻率會下降。SareinaChiung-YuanWu等［1］發現piggyBac轉座酶與GAL4DNA結合區域耦合會維持piggyBac轉座子的轉座活性。此外，在轉座酶載體上，啟動子的不同會影響轉座酶的表達量，從而影響轉座效率。

3.2細胞類型

并不是所有細胞類型都適用于piggyBac轉座子載體進行轉染，這主要參考細胞的傳代培養和細胞活力等因素。piggyBac轉座子載體系統最初運用于哺乳動物細胞研究時，選擇的是哺乳動物的胚胎干細胞，就是根據哺乳動物的胚胎干細胞具有較高的細胞活力和無限增殖的潛能。DNA的復制觸發細胞的分裂增殖，且DNA的復制通常發生在細胞分裂的G1/S期，轉座子的轉座一般發生在DNA復制的過程中。DNA復制時，雙鏈解開，DNA聚合酶和DNA結合蛋白等會與單鏈結合，促使DNA復制。同時，RNA聚合酶和轉錄結合因子會觸發轉座酶的表達，在轉座酶的存在下，轉座子會在宿主基因組內發生跳躍。此外，載體上piggyBac轉座子所介導的基因片段長度大小也會影響轉座子插入和剪切的準確性，會影響轉座子的整合位點數目。

4piggyBac轉座子在哺乳動物轉基因中的應用

piggyBac轉座子介導的轉基因已經在人和老鼠胚胎肝細胞上進行研究，且在成年老鼠細胞中，Gaussia熒光素酶(Gluc)基因表達持續時間超過2個月［7］。piggyBac轉座子由于具有識別位點特異性和高效轉座的特點已成功介導誘導多潛能老鼠肝細胞(iPSCs)的產生［8］。Chikara等［9］將Cre/LoxP系統與piggyBac轉座子結合在老鼠上檢測到大量順式調控元件。Cre/LoxP系統與piggyBac轉座子的結合在理論上消除了piggyBac轉座酶對轉座的干擾，然而，在實際操作過程中，卻是難以避免的。昆蟲作為一種模式動物，其研究已經很深入，或許我們可以借鑒Tarig等［10］的思路(圖3)，將轉座子載體進行改造，從而提高轉座的穩定性。質粒是由兩對相反的轉座子末端組成，分別是A、B、C和D。這樣就有4個潛在的轉座子(A-D，A-B，C-D和C-B)。通過對標記基因M2的篩選，期望的A-D轉座子插入到宿主基因組中。原理上，側翼的A-B和C-D轉座子通過再一次暴露在轉座酶的環境下而被切除，最后插入的片段因為沒有轉座子的末端，所以轉座酶對插入的片段沒有剪切作用。