本文作者：閆琳 王曉英 郭云昌 單位：中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所

PCR-ELISA是利用了PCR技術(shù)的高敏感性、核酸探針的特異性、酶標(biāo)儀直接讀取結(jié)果的客觀性等優(yōu)點(diǎn)建立的一項(xiàng)技術(shù)。PCR-ELISA只需要具備PCR儀和酶標(biāo)儀即可實(shí)施，且其靈敏度及特異性均較高，下面就PCR–ELISA技術(shù)及其在國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1PCR-ELISA技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)自誕生以來，在各個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的方法主要是凝膠電泳EB熒光顯色法，以定性檢測為主，只能粗略的相對(duì)定量，靈敏度低，易產(chǎn)生假陰性和假陽性結(jié)果，另外EB還具有致癌性。NIEMEYER等創(chuàng)建了應(yīng)用固相捕獲的PCR定量技術(shù)，即在PCR擴(kuò)增以后借用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理，使用酶標(biāo)抗體，通過雜固相或液相雜交來實(shí)現(xiàn)定量檢測［1］，被稱為PCR-ELISA，它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR檢測方法的不足。該檢測技術(shù)主要包括三個(gè)部分，分別為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、擴(kuò)增產(chǎn)物與探針的雜交及常規(guī)ELISA酶標(biāo)顯色［2］。通常PCR-ELISA技術(shù)需要借助生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)［3］。最初的PCR-ELISA采用夾心雜交法，包括捕獲探針，擴(kuò)增產(chǎn)物和檢測探針，后經(jīng)過改進(jìn)，在PCR過程中給目的片段摻入標(biāo)記物，使擴(kuò)增的產(chǎn)物也具有檢測探針的功效，即為直接雜交法。常規(guī)的PCR-ELISA只能作為一種定性試驗(yàn)，但若加入內(nèi)標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可達(dá)到定量檢測的目的。

2在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1致病菌檢測

PCR-ELISA用于致病菌的檢測，通過PCR擴(kuò)增、雜交及酶顯色放大，使得該方法具有高的敏感性和特異性，而且應(yīng)用96孔微孔板，可以同時(shí)檢測多份樣本，保證了檢測的時(shí)效性和準(zhǔn)確性，適于大量樣本的篩選。國外對(duì)PCR-ELISA技術(shù)應(yīng)用于致病菌的研究開展的較早，國內(nèi)這方面的報(bào)道較少。在食物樣本檢測方面，PERELL等用PCR-ELISA法，檢測205份鮮奶樣本和300份牛肉餡樣本中可編碼志賀毒素的大腸埃希菌(STEC)，檢出率分別為21%和15%，結(jié)果表明，PCR-ELISA對(duì)食品原料中STEC高致病性血清群的快速檢測有助于STEC食物中毒的危險(xiǎn)性評(píng)估［4］。HONG等用PCR-ELISA檢測禽肉中大腸彎曲菌，空腸彎曲菌和腸炎沙門菌，針對(duì)彎曲菌的ceuE基因和沙門菌的invA基因設(shè)計(jì)特異性探針，PCR擴(kuò)增后用ELISA進(jìn)行檢測，比傳統(tǒng)的電泳檢測法敏感性提高了100～1000倍，最低可以檢測到40CFU/ml彎曲菌和200CFU/ml沙門菌［5］。作者認(rèn)為PCR-ELISA是一種快速高效的用于禽肉中沙門菌和彎曲菌檢測和計(jì)數(shù)的方法。2009年，曹瑋等建立了檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌hlyA基因的PCR-ELISA方法，并通過人工染菌牛奶樣本，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果證明該方法和細(xì)菌學(xué)上傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢出符合率為100%。經(jīng)過12h前增菌，PCR-ELISA的檢出限為1cfu/25ml牛奶樣本，比電泳法敏感10～100倍，具有良好的敏感性，特異性和可靠性，認(rèn)為這種方法將有助于提高食源性疾病的預(yù)警預(yù)報(bào)能力，增強(qiáng)檢測方法的準(zhǔn)確性［6］。在環(huán)境樣本檢測方面，KUO等以大腸菌群特異的16srRNA為探針，用PCR-ELISA法檢測水樣中的典型大腸菌群，檢測時(shí)限4h，誤差率為1.4%，總大腸菌群的檢出限為5cfu/100ml水樣［7］。對(duì)比研究顯示PCR-ELISA法不論在時(shí)間，檢出限和準(zhǔn)確度上都優(yōu)于目前的傳統(tǒng)方法。Soheili采用PCR-ELISA方法檢測工業(yè)冷凝水中的嗜肺軍團(tuán)菌，以16srRNA為目的片段，選用特異性引物進(jìn)行巢氏PCR，帶有DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和生物素標(biāo)記的探針雜交，通過POD標(biāo)記的抗DIG抗體在顯色反應(yīng)中檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)共檢測了5份冷凝水樣本，所有樣本培養(yǎng)法和PCR-ELISA都檢出陽性，與細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，PCR－ELISA特異性更高，檢測速度更快，作者認(rèn)為該方法適用于工業(yè)冷凝水嗜肺軍團(tuán)菌污染的常規(guī)檢測［8］。在致病菌臨床樣本檢測方面，YAM等用單管生物素化的巢氏PCR-ELISA法，共檢測659例結(jié)核桿菌的H37RvDNA，敏感性為97%，特異性為100%。對(duì)H37RvDNA進(jìn)行系列稀釋，當(dāng)A405=0.6時(shí)，該方法的檢出限為0.75cfu/每反應(yīng)。結(jié)果表明PCR-ELISA是一種敏感性高、成本低廉的分子診斷方法，適用于結(jié)核病發(fā)病率高的發(fā)展中國家的臨床診斷［9］。MOUSAVI等通過PCR擴(kuò)增獲得編碼霍亂毒素B亞基的基因，采用PCR-ELISA法快速篩查伊朗南部產(chǎn)毒的霍亂弧菌O1菌株。結(jié)果表明，該方法具有較好的特異性和敏感性。檢測限為0.5pg基因組DNA/每反應(yīng)，即相當(dāng)于5個(gè)菌細(xì)胞/每反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明PCR－ELISA檢測霍亂弧菌O1菌株毒素基因更加快速和簡便［10］。

2.2轉(zhuǎn)基因食品檢測

目前國外已經(jīng)開發(fā)出用于檢測轉(zhuǎn)基因食品的PCR-ELISA試劑盒，我國也已建立了轉(zhuǎn)基因食品(如大豆，水稻，魚)的PCR-ELISA檢測法。雷勃鈞等用PCR-ELISA法對(duì)大豆品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因的定性檢測，靈敏度高達(dá)0.1%［11］，足以達(dá)到歐盟1%檢測閾值的要求。歐盟利用PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的35S啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行水平測試時(shí)，檢測靈敏度達(dá)到1%［12］，而利用PCR-ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢比歐盟推薦PCR方法提高5～10倍。陳茹等先針對(duì)轉(zhuǎn)基因魚中mMT啟動(dòng)子和hGH基因建立了Dig－PCR-ELISA方法，5μlPCR產(chǎn)物經(jīng)1000倍稀釋仍可以檢測出，與常規(guī)PCR－電泳檢測方法相比敏感性可提高至100～1000倍［13］。后來又針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中普遍存在的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶NOS終止子(Tnos)，建立了Dig–PCR-ELISA檢測方法，可檢測含量僅為0.1%的轉(zhuǎn)基因樣品，實(shí)現(xiàn)了半定量檢測［14］。LAETITIA等以35S啟動(dòng)子或Bt176特異結(jié)合序列為目的片段的PCR-ELISA法篩選和檢測面粉和淀粉類食物中的轉(zhuǎn)基因Bt176玉米。結(jié)果表明這種方法是非常特異的，其敏感度和southern雜交相當(dāng)，至少是凝膠電泳的6倍。用它來檢測Bt176、Bt11、Mon810轉(zhuǎn)基因玉米和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，靈敏度可以達(dá)到0.1%。作者認(rèn)為PCR-ELISA是篩選鑒定面粉和天然淀粉中轉(zhuǎn)基因Bt76玉米的一種可選方法，比起實(shí)時(shí)PCR更加便宜，在實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測中是非常有用的［15］。綜上所述，在不同的轉(zhuǎn)基因食品中用PCR-ELISA法，檢測的靈敏度都達(dá)到了0.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了凝膠電泳法，超越倍數(shù)最高可達(dá)1000倍。

2.3病毒檢測

目前國內(nèi)外應(yīng)用PCR-ELISA技術(shù)檢測的病毒主要有肝炎病毒、腸病毒及禽流感病毒等。李稻等采用液相雜交技術(shù)，簡化核酸雜交過程，建立乙肝病毒(HBV)PCR-ELISA方法，檢測靈敏度達(dá)1×104拷貝/ml，大三陽標(biāo)本的檢出率為97.1%，小三陽標(biāo)本的檢出率為67.7%。故作者認(rèn)為使用該技術(shù)可使實(shí)驗(yàn)操作簡便、快速，適合臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用［16］。2006年，CHAHARAEIN等建立RT－PCR-ELISA法檢測禽流感病毒亞型H9N2。對(duì)H9N2接種雞的導(dǎo)管拭子樣本連續(xù)稀釋，用PCR-ELISA和傳統(tǒng)的病毒細(xì)胞培養(yǎng)分離法分別進(jìn)行檢測，結(jié)果表明兩者的檢出限相似，并且PCR-ELISA法比PCR凝膠電泳法敏感性至少高10倍，因此作者認(rèn)為該方法可用于檢測雞群中A型流感病毒，特別是H9N2亞型［17］。