作者：趙梅 張紹鈴 齊開杰 衡躍進 陶書田 單位：南京農業大學梨工程技術研究中心 寶應縣奕佳農牧有限公司

實驗方法

挑選健康的幼果，去皮去核，果肉切成小塊，液氮研磨成粉末，稱取一定質量的粉末，按一定的提取條件在恒溫搖床中勻速浸提，將粗提液離心過濾后，測定并計算多酚得率。梨幼果多酚含量的測定采用福林酚法（Folin-Ciocalteu）[6]測定，以沒食子酸為基準物質，計算梨幼果多酚含量。回歸方程為y=8.5095x+0.0111，R2=0.9984。梨幼果多酚得率的計算多酚得率/(mg/g)=C×V×N/m，式中：C為提取液中多酚質量濃度/(mg/mL)；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數；m為梨幼果果肉質量（g）。梨幼果多酚提取的單因素試驗選取乙醇濃度、提取時間、提取溫度、提取料液比為影響因素，進行單因素試驗。

乙醇濃度對梨幼果多酚得率的影響采用不同的乙醇濃度10%、30%、50%、70%、90%，固定提取時間5h，提取溫度60℃，提取料液比1:20（g/mL），研究不同乙醇濃度對梨幼果多酚得率的影響。提取時間對梨幼果多酚得率的影響采用不同的提取時間2、4、6、8、10、12h，固定乙醇濃度50%，提取溫度60℃，提取料液比1:15(g/mL)，研究不同提取時間對梨幼果多酚得率的影響。提取溫度對梨幼果多酚得率的影響采用不同提取溫度20、40、60、80、100℃，固定乙醇濃度50%，提取時間1.5h，料液比1:20（g/mL），研究不同提取溫度對梨幼果多酚得率的影響。

料液比對梨幼果多酚得率的影響采用不同提取料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，固定乙醇濃度50%，提取時間5h，提取溫度60℃，研究不同提取溫度對梨幼果多酚得率的影響。梨幼果多酚提取的正交試驗在單因素試驗的基礎上，進一步考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度、提取料液比對梨幼果多酚得率的影響，設計4因素3水平L9（34）的正交試驗。梨幼果酚類物質HPLC分析提取物經過0.45μm微濾膜過濾后，利用色譜儀進行測定。高效液相色譜分析條件[4]：色譜柱，C18柱150mm×4.6mm，Φ5μm；流動相，甲醇和水；柱溫，30℃；流速，0.6mL•min-1；進樣量，5μL；紫外檢測器，波長280nm。流動相A：水，用磷酸調pH3.2；B：甲醇。線性梯度淋洗程序，時間（min）/B（%）：0/2，3/2，4/25，11/50，16/80，26/80，30/2，35/2。數據統計分析利用Excel和SPSS17.0統計軟件對獲得的數據進行統計分析。

結果與分析

1提取條件的單因素試驗

1.1乙醇濃度對梨幼果多酚得率的影響由圖1可以看出乙醇濃度低于70%時，隨著乙醇濃度增加，梨幼果多酚得率也逐漸提高；乙醇濃度高于70%時，多酚得率隨著乙醇濃度的增加而下降。乙醇濃度過低，多酚得率低，可能是因為多酚類物質在植物體內通常與蛋白質、多糖等以氫鍵和疏水鍵形成穩定的分子復合物，而水斷裂氫鍵的作用較弱，提取液中水的比例過高時，不足以破壞樣品中多酚類物質與蛋白、多糖或其他物質的連接，多酚得率低[7]；乙醇濃度過高，多酚得率低，可能是因為溶出較多醇溶性雜質、色素、親脂性較強的成分，這些成分與多酚類化合物競爭同一乙醇水分子[8]。乙醇濃度為50%和70%時，多酚得率之間沒用顯著性差異，考慮到工業成本，確定最佳乙醇濃度為50%。

1.2提取時間對梨幼果多酚得率的影響如圖2所示，當提取時間達到4h，多酚得率最高，繼續延長提取時間，多酚得率開始下降。這是因為隨著時間加長，可以使多酚充分溶解于溶劑中，但時間過長會因為溫度的影響發生降解、縮合、氧化等化學反應[9]。此外，時間越長，耗能越大[10]，故選擇最佳提取時間為4h。

1.3提取溫度對梨幼果多酚得率的影響由圖3可知在所設計的溫度范圍內，多酚得率隨溫度的升高而呈增大趨勢。在20～40℃之間，多酚得率上升速率最慢，40～60℃之間，多酚得率的升高最明顯，60～100℃之間，多酚得率的增量有所下降。可能是由于隨著溫度的升高，一方面有利于未游離出來的多酚的浸出[11-12]，另一方面，也促進已經提取出來的多酚的氧化與降解[13]。故綜合考慮選擇最佳提取溫度為60℃。

1.5料液比對梨幼果多酚得率的影響由圖4可以看出，隨著料液比的增大，多酚得率逐漸增加,當料液比到達1:25以后，料液比繼續增大，多酚得率增加緩慢。這可能是由于料液比為1:25時，溶劑已經能將梨幼果中多酚提取出來，繼續增加料液比，并不能顯著提高多酚得率。而且料液比過高，不利于回收，且造成浪費。因此，從提取效果、經濟角度方面考慮，料液比選擇1:25較為合適。

2正交試驗優化梨幼果多酚提取條件

通過各因素的極差R（表2）比較發現RB>RA>RD>RC，極差R越大，其對應因素對梨幼果多酚得率影響越大。因此，本試驗影響因子的先后順序為提取溫度>乙醇濃度>提取料液比>提取時間。將極差最小的因素（提取時間）作為誤差項，方差分析（表3）進一步表明，提取溫度和乙醇濃度是影響幼果多酚得率的主要因素。梨幼果多酚提取最佳提取組合為A3B3C1D3，即乙醇濃度60%，提取溫度70℃，提取時間2h，提取料液比1:30（g/mL），依照此組合進行提取試驗，多酚得率可達到1.47mg/g。

3梨幼果多酚物質HPLC分析結果

利用高效液相色譜法可以較好地分離各種酚類成分，標樣中11種組分的出峰順序依次為熊果苷、沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、香草醛、阿魏酸、蘆丁、根皮苷、槲皮素（圖5-A）。梨幼果樣品中測定出9種酚類物質（圖5-B），未檢測到根皮苷和槲皮素。檢測出的酚類物質中熊果苷含量最高，為總含量的74.1%；兒茶素、綠原酸、香草醛含量較高，為主要的酚類物質；沒食子酸含量最低。

結論

本文對梨幼果多酚提取條件進行了優化，并利用高效液相色譜分析其組分，為梨果實酚類物質代謝研究和生物資源的利用提供了可靠的理論依據和技術方法。正交試驗和方差分析結果表明提取溫度、乙醇濃度對梨幼果多酚得率的影響是顯著的，最佳提取工藝組合：乙醇濃度60%，提取溫度70℃，提取時間2h，提取料液比1:30（g/mL），依照此水平進行提取試驗，多酚得率可達到1.47mg/g。通過高效液相色譜分析可知，梨幼果主要含有熊果苷、兒茶素、綠原酸、香草醛等多酚物質，其中熊果苷含量最高，為總含量的74.1%。熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶活性，抑制皮膚黑色素的形成，是目前國內外美白化妝品中的主要原料[14]。因此，梨幼果可作為化妝品美白劑熊果苷的天然原料，是潛在的生物資源。