釘螺是日本血吸蟲的唯一中間宿主，我國現有釘螺面積95%以上分布在長江流域的湖沼地區［12］。這些地區因長江水位不穩定，環境復雜，常規藥物滅螺難以達到理想效果。始于20世紀80年代的林業血防工程，通過環境改造形成以林業為主的林、農、副、漁等有機結合的自然經濟社會復合生態系統，以改變釘螺適宜生存的溫度、土壤濕度、光照、植被等環境因子，從而抑制釘螺孳生，達到抑螺防病的目的［34］。安徽省自實施興林滅螺項目以來，在灘地通過適當的工程技術措施，栽植耐水濕樹種并間種農作物，有效地改變釘螺的孳生環境，釘螺密度大為降低，同時釘螺的生理生化也可能發生變化［56］。為探討釘螺在生態改變后環境脅迫下的分子水平變化，本實驗通過采集長江安徽段上中下游3地林業血防工程示范點和草灘對照點的釘螺，對釘螺細胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因擴增和測序，建立系統發生樹，從分子生物學角度進行探討，從而為從分子水平上研究興林抑螺的機制提供依據。

1材料與方法

1.1釘螺樣本

分別在長江安徽段上游安慶新洲（AQL）、中游銅陵胥壩（TLL）、下游無為劉渡（WWL）的林業血防工程區，同時在上述3個林業血防工程區鄰近區域各選擇1塊草灘環境作為對照區，即安慶草灘（AQC）、銅陵草灘（TLC）、無為草灘（WWC），于2011年春季現場采集一定數量釘螺，室內短期飼養后以逸蚴法剔除血吸蟲感染性釘螺后的樣本作為實驗材料，洗去淤泥后放無水乙醇中4℃保存。

1.2試劑

大腸埃希菌（E.coli）DH5α為本實驗室保存，pMD18Tvector購自大連TaKaRa公司。DNA提取試劑盒（K703，DNAzsolE，購自上海博彩公司），pfuDNA聚合酶，dNTPs、DNA標志物和瓊脂糖均購自大連TaKaRa公司。

1.3基因組

DNA提取采用基因組DNA提取試劑盒，從釘螺頭足部肌肉組織中提取DNA，DNA用TE溶解后，測定DNA純度和濃度，-20℃保存備用。

1.4PCR擴增

COⅠ基因及產物鑒定引物設計根據參考文獻［3］，序列如下：上游引物：5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′；下游引物：5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAYCA3′。PCR反應總體積25μl，包括ddH2O15.5μl，10×Buffer2.5μl，dNTP2μl，模板DNA3.5μl，10μmol/L上、下游引物各0.5μl，pfuDNA聚合酶0.5μl。循環條件為：95℃預變性10min，94℃變性1min，51℃退火90s，72℃延伸105s，共進行35個循環，末次循環72℃延伸10min。PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，，凝膠成像系統觀察照相。

1.5PCR產物

TA克隆與測序采用膠回收試劑盒回收純化PCR產物，在T4DNA連接酶的作用下，純化產物與pMD18Tvector，16℃連接45min。重組質粒轉化入感受態細菌E.coliDH5α，然后均勻涂布于含Xgal和IPTG的AMP+平板中進行藍白斑篩選，PCR鑒定后，挑選陽性克隆菌液送上海英駿生物技術公司測序。1.6COⅠ基因序列分析從GenBank中檢索出微小釘螺（DQ212795，WX）、雙臍螺（AF199111，SQ）作為外群參照序列［78］。將測序結果用ClustalX（1.81）軟件進行多序列比對，MEGA3.1軟件Kimura2parameter法計算遺傳距離，非加權組平均法（UPGMA）和鄰近法（NJ）構建系統發生樹，Bootstrap進行檢驗。

2結果

2.1試點概況

3個林業血防工程區基本情況見表1。

2.2COI基因擴增

以安慶、銅陵、無為工程區和草灘區6個不同環境釘螺基因組DNA為模板，PCR特異性擴增mtDNACOⅠ基因，擴增產物經1%瓊脂糖電泳，利用合成的引物擴增出約700bp（含兩端引物）的片段，與預期目的片段大小一致成蟲開始產卵有關。Yoshio等［10］發現在曼氏血吸蟲感染后的產卵期，不管是Th17型還是Th1型免疫反應均會受到抑制。但迄今為止，蟲卵誘導Th17型和Th1型免疫反應下調的具體機制還不是很清楚。Romagnani［11］報道了IL4在促進Th2細胞分化的同時抑制了Th17細胞的分化，而Th1型免疫反應的抑制也與IL4（Th2型）和IL10（Treg）的高表達有關。因此我們推測，進入產卵期后，IL17介導的Th17反應和Th1型反應有可能逐漸向Th2反應偏移。

在轉錄水平的研究中發現，感染日本血吸蟲后小鼠體內IL17A及IL23p19的mRNA和蛋白表達水平變化基本上是一致的。但值得注意的是，在感染4周后，IL17A及IL23p19mRNA的表達出現了升高的趨勢，這與同期蛋白表達水平變化不一致，其原因一方面可能是mRNA與蛋白水平的表達本身是不盡相同的，另一方面可能是由于蛋白表達具有時效性，同一時間的mRNA表達水平不能代表蛋白水平。通過相關性分析我們還發現，在感染小鼠的脾臟組織中，IL17A和IL23p19的mRNA表達呈正相關，進一步證實了IL23對血吸蟲感染后小鼠脾臟組織中Th17細胞的增殖和存活具有重要意義，可促使其分泌IL17，從而介導一系列的免疫反應。

本研究證實了炎癥細胞因子IL17和IL23在日本血吸蟲自然感染早期的表達水平升高，說明Th17細胞分泌的IL17作為一種重要的炎性因子，參與了血吸蟲病的發生發展過程，并且IL23在這一過程中也發揮了重要的作用。本次研究我們只對IL17A及IL23p19兩種細胞因子進行了檢測，下一步我們將在細胞水平上對Th17細胞以及Th細胞其它亞群進行研究，以進一步揭示血吸蟲感染免疫機制以及宿主與寄生蟲的相互關系。