基于高通量測序技術的中溫大曲中微生物群落多樣性解析

　　摘要：采用高通量測序技術對河南省某酒企中溫大曲曲皮和曲心兩個部位的真菌群落和細菌群落的多樣性及其組成進行了研究.結果表明：1)中溫大曲曲皮樣品中真菌群落多樣性和豐度均高于曲心樣品;子囊菌門是大曲曲皮和曲心樣品中的唯一優勢菌門;大曲樣品中共檢測到15種真菌，其中扣囊復膜孢酵母、雪黃散囊菌和畢赤酵母sp1為曲皮和曲心樣品中的優勢真菌，扣囊復膜孢酵母在曲皮和曲心樣品中的含量基本一致，而雪黃散囊菌和畢赤酵母sp1在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大.2)中溫大曲曲心樣品中細菌群落多樣性高于曲皮樣品，但其豐度低于曲皮樣品;在大曲樣品中共檢測到28個屬，其中腸桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、布氏桿菌屬、腸球菌屬和歐文氏菌屬為大曲樣品中的優勢細菌屬，除布氏桿菌屬外，其他優勢細菌屬在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大.

　　關鍵詞：白酒;中溫大曲;微生物群落;高通量測序技術

　　《微生物學通報》主要刊登微生物學、生物工程、病毒學、酶工程、發酵工程、細胞工程等領域的最新研究成果，產業化新技術和新進展。

　　0 引言

　　曲作為一種糖化劑、發酵劑、產香劑和原料，在制酒、制醋、制醬油等傳統釀造行業的應用已有幾千年的歷史.其中，大曲主要用于白酒固態發酵[1]，其品質的優劣在很大程度上決定了白酒的品質和風格.大曲主要是以大麥、小麥、豌豆等單一或多種谷物為原料，經破碎、加水混合再壓成塊狀曲醅[2]，經自然或人工接種并在適宜的溫度和濕度條件下進行固態發酵，經成型、控溫、貯存等十幾個環節而制成塊曲或磚曲.制曲過程中，純種或環境中的微生物在適宜的條件下經過長時間的富集和培養，可在曲醅表面和內部形成有益的釀酒微生物群系[3].大曲微生物菌群復雜，主要集中在酵母菌、霉菌和細菌三類菌中，三者在釀酒過程中的糖化、產香、產酒方面可以協同作用，但各自側重不同[4]：酵母菌有酒化和酯化的作用;霉菌助產一些生物酶，如紅曲霉和米根霉產酯化酶，黑曲霉助產淀粉酶、蛋白酶和糖化酶[5-6];細菌助產一些呈香物質，如吡嗪類化合物、愈創木酚、苯甲醛、乳酸、芳香族化合物等多種香氣成分.此外，大曲中還有少量的放線菌，其功能雖然尚不明確，但其可以產生蛋白酶，使蛋白質分解成氨基酸，進而與淀粉分解生成的糖反應會產生醛、酮、吡嗪類化合物等香味物質.

　　目前，關于大曲群落信息研究的報道很多[7-8]，其所采用的方法包括傳統可培養方法[9]、傳統分子生態學方法(16s rDNA克隆文庫法[10]、PCR|DGGE[11]，擴增核糖體DNA限制性分析[12]和PLFA[13]等)和高通量測序技術[14].尤其是高通量測序技術的應用，使得大曲中痕量微生物和不可培養微生物得以被發現，極大地豐富了人們對大曲中微生物群落多樣性的認識.目前對產自四川、貴州等地區的大曲微生物的研究較多，但對產自河南地區的大曲微生物群落的研究相對較少，且對產自河南地區的大曲曲皮和曲心微生物群落差異尚不明晰.基于此，本文擬采用高通量測序技術研究河南地區中溫大曲曲皮和曲心兩個部位的微生物群落多樣性及其組成，以期拓展對河南地區中高溫大曲中微生物種類的研究，在一定程度上豐富對我國不同地區中溫大曲微生物多樣性的認識.

　　1 材料與方法

　　1.1 材料和儀器

　　1.1.1 樣品采集 中溫大曲樣品，取自河南某知名酒廠，取曲塊表面厚度約為1 cm的大曲作為曲皮樣品，粉碎后備用; 在曲塊中心，取長、寬、厚均為5 cm的正方體作為曲心樣品，粉碎后備用.

　　1.1.2 主要試劑 2×Taq PCR MasterMix，上海天根生物公司產;引物ITS1/ITS4和515F/806R，

　　氯化鈉、苯酚、氯仿，生工生物上海股份有限公司產;無水乙醇，上海聯碩生物技術有限公司產;Triton X-100，上海碧云天生物技術有限公司產;SDS，美國Amresco公司產;Tris，北京索萊寶科技有限公司產;EDTA，上海國藥集團化學試劑有限公司產;醋酸銨，天津市科密歐化學試劑有限公司產.以上試劑均為分析純.

　　1.1.3 主要儀器 MP200A型精密電子天平，上海良豐儀器儀表有限公司產; TG16-WS型臺式高速離心機，安徽中佳科學儀器有限公司產;DKY-Ⅱ型恒溫調速回轉式搖床，倍輝北京產品部產;ZDX-35B型滅菌鍋，上海三申醫療器械廠產;SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產;JY92-Ⅲ型PCR儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產;DYY-8C型瓊脂糖電泳儀，北京市六一儀器廠產.

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 基因組提取

　　1.2.1.1 樣品預處理 分別稱取7 g大曲曲皮和曲心樣品，用20 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS緩沖液懸浮，加入3—5顆玻璃珠，漩渦振蕩5 min后在300 r/min轉速下離心5 min，取上清液，沉淀用PBS緩沖液重復洗滌3次，離心后合并上清液.將上清液于9000 r/min轉速下離心3 min，棄去上清液，收集細胞沉淀.再用 5 mLPBS緩沖液重復洗滌3次，每次于9000 r/min轉速下離心3 min，收集細胞沉淀.最后將細胞沉淀用1.5 mL PBS緩沖液重新懸浮，該懸浮液用于基因組提取.

　　1.2.1.2 DNA的提取 上述懸浮液中DNA的提取參照H.Y.Wang等[15]的方法.

　　1.2.2 PCR擴增與高通量測序 采用原核微生物16S rRNA基因序列V4可變區設計的通用引物515F/806R[16]和真核生物通用引物ITS1/ITS4分別對上述基因組進行PCR擴增，兩種引物的PCR擴增和高通量測序方法分別參照胡曉龍[17]和朱文優[18]的方法進行.

　　1.2.3 數據處理

　　1.2.3.1 序列質量控制 采用Cutadapt(v1.9.1)，Vsearch(1.9.6)，Qiime(1.9.1)分析軟件對所測原始序列進行質量控制：首先，將每對雙向測序的序列進行比對，根據比對的末端重疊區進行拼接，拼接時保證至少有20 bp的重疊區，去除拼接結果中含有N的序列;接著，去除引物和接頭序列，去除兩端質量值低于 20 bp的堿基，去除長度小于200 bp的序列;最后，將上面拼接過濾后的序列與數據庫進行比對，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據.

　　1.2.3.2 操作分類單元(OTU)分析 采用Qiime′s uclust程序將相似度為97%的有效序列歸為一個OTU，并確定每個OTU的代表序列[17].將獲得的每個OTU的代表序列與RibosomalDatabase Project(RDP)在線數據庫進行比對，選取置信度為80%的閾值對上述序列進行分類，進而確定每個OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬、種水平.

　　2 結果與討論

　　2.1 大曲樣品中真菌群落多樣性及其組成分析

　　2.1.1 大曲真菌群落多樣性

　　大曲真菌群落稀疏曲線如圖1所示.由圖1可知，當測序深度超過10 000序列時，曲皮和曲心樣品中真菌群落Observed OTU數目基本不再增加，稀疏曲線趨于平緩.由于本實驗所測序列深度遠高于10 000條，因此，本文所選取樣品有效測序數量能夠較全面地反映待測大曲樣品的真菌群落多樣性信息.

　　大曲真菌群落多樣性指數見表1.由表1可知，經過Illumina Miseq高通量測序和序列質量控制，曲皮和曲心樣品中真菌菌群中所得有效序列分別為66 850條和 70 954條.曲皮樣品中真菌群落的Shannon和 Chao1指數均略高于曲心樣品，表明曲皮樣品中真菌群落多樣性和豐度高于曲心樣品.這可能是由于在制曲和存放過程中曲皮和空氣或地面直接接觸，氧氣充足，而曲心溫度高于曲皮且氧含量低于曲皮，進而導致曲皮真菌群落多樣性和豐度高于曲心，這與李燕榮等[19]的研究結果一致.

　　2.1.2 大曲真菌群落組成 大曲曲皮和曲心樣品中真菌群落組成如圖2所示.由圖2可知，代表性OTU序列的物種注釋結果表明，除“門”水平外，大曲曲皮和曲心樣品在不同分類水平上存在一定的差異.

　　在“門”水平(圖2a))，子囊菌門(Ascomycota)是曲皮和曲心樣品中的唯一優勢(相對含量≥1%)菌門，相對含量均大于99%，同時也是四川和安徽等地區中溫大曲中的優勢真菌菌門[18，20].

　　在“綱”水平(圖2b))，酵母綱(Saccharomycetes)和散囊菌綱(Eurotiomycetes)為大曲樣品中的優勢真菌，且其中酵母綱的相對含量遠高于散囊菌綱的相對含量;較之于曲心，曲皮樣品中酵母綱相對含量較高，散囊菌綱相對含量較低.

　　在“目”水平(圖2c))，酵母菌目(Saccharomycetales)和散囊菌目(Eurotiales)為大曲樣品中的優勢微生物，同時也含有少量的毛霉目(Mucorales).

　　在“科”水平(圖2d))，共檢測到9個科，其中復膜孢酵母科(Saccharomycopsidaceae)、發菌科(Trichocomaceae)、畢赤酵母科(Pichiaceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)為大曲樣品中的優勢菌科，其在曲皮和曲心樣品中的平均相對含量分別為65.3%，27.2%，3.5%和2.2%.較之于曲心樣品，曲皮中畢赤酵母科(6.3%)和酵母科(4.1%)的相對含量較高;復膜孢酵母科在曲皮(65.4%)和曲心(65.2%)中的相對含量差別不大;發菌科(23.3%)的相對含量較低.