27種植物提取物抗煙草花葉病毒活性分析

　　摘要：以煙草花葉病毒(TMV)為模式病毒，采用半葉枯斑法及葉圓片法，對27種植物提取物的抗TMV活性進行篩選。結果表明：在濃度為1mg/mL時12種植物提取物對TMV有治療作用，其中藿香薊對TMV的治療作用最顯著，抑制率為53.06%，與陽性對照藥劑寧南霉素(57.33%)相比無顯著差異。8種植物提取物對TMV侵染具有保護效應，其中馬桑的保護活性最高，抑制率達53.64%;其次為銀膠菊和黑蒿，抑制率分別為46.51%和36.63%。9種植物提取物對TMV有體外鈍化作用，其中革命菜、蕁麻和藿香薊3種植物提取物的鈍化活性較強，抑制率分別是62.20%、54.92%和51.75%。22種植物提取物對TMV增殖有抑制活性，且活性高于或相當于陽性對照寧南霉素處理組，其中水麻、香絲草處理組的病毒含量相當于健康煙葉，表明其能完全抑制TMV增殖。

　　本文源自西南林業大學學報(自然科學),2020,40(05):93-99.《西南林業大學學報》是由西南林業大學主辦的林業類綜合性學術期刊，主要刊登森林生物學、林木遺傳育種、森林培育、森林保護、森林經理、野生動植物保護與利用、園林植物與風景園林、水土保持與荒漠化防治、木材科學與技術及林產化學等方面具有創新性的原始科研成果。讀者對象為國內外農林科技工作者及高等院校師生。該刊1981年創刊，國內外公開發行，面向全國組稿。

　　病毒是僅次于真菌的第二大作物病害，素有“植物癌癥”之稱[1]。煙草花葉病毒(TMV)侵染的寄主范圍很廣，可侵染茄科、十字花科、菊科等36科400多種植物[2]。由TMV引發的煙草花葉病毒病是煙草的主要病害，造成煙草產量和品質的嚴重下降，且TMV性質穩定在環境中極易通過植物和機械工具傳播，給煙草產業帶來嚴重損失。我國南方煙草種植地區，煙草早期發病造成的損失可達50%～70%[3,4]。通過化學藥劑防治煙草花葉病毒病是現在主要的防治措施，但大量使用化學藥劑會使煙草花葉病毒產生耐藥性，同時帶來環境污染問題，嚴重影響人類健康。迄今為止尚未發現能徹底防控TMV的生物藥劑，因此篩選并開發高效、低毒的植物病毒抑制劑十分迫切。

　　全世界有1/3的藥物均是從植物中開發而來。植物中含有豐富的次生代謝物質，這些次生代謝物形成的病毒抑制劑作用方式獨特，具有良好的環境兼容性。研究抗病毒藥劑的一個重要來源是從植物提取物中篩選活性物質[5]。許多藥物研發項目中，天然產物是重要且可行的先導化合物來源[6]。我國植物資源豐富，目前已發現多種植物提取物具良好的抗TMV活性[7,8,9]。從植物中尋找抗TMV活性物質是開發抗病毒藥劑的一個重要來源。本研究對27種植物提取物進行初步抗TMV活性篩選，為開發新型抗病毒制劑提供依據。

　　1、材料及方法

　　1.1試驗材料

　　1.1.1供試植物

　　27種植物材料于2018年5—8月采自云南昆明、廣西賓陽、遼寧喀左等地，具體信息見表1。

　　表1供試植物名錄

　　1.1.2供試病毒

　　由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所提供的煙草花葉病毒普通株系U1。繁殖于普通煙K326上，采用魏遠方[10]的方法進行煙草花葉病毒提純，濃度用紫外分光光度計測定為16mg/mL，置于-80℃冰箱中保存，備用。

　　1.1.3供試寄主

　　TMV局部侵染寄主心葉煙、TMV系統侵染寄主普通煙K326，漂盤育苗，移栽于無蟲溫室中培育，待煙苗長至4～6片真葉時進行活性測定。

　　1.2試驗方法

　　1.2.1植物提取物的制備

　　植物材料風干粉碎，稱取200g樣品，乙醇回流提取3次，每次4h，合并并濃縮3次提取液，得乙醇提取物，二甲基亞砜(DMSO)溶解稱取的一定提取物，配成100mg/mL母液，置于4℃冰箱備用，臨時用蒸餾水稀釋置1mg/mL。

　　1.2.2抗TMV活性測定

　　采用活體半葉枯斑法測定提取物對TMV侵染的抑制活性[11]。挑選健康長勢一致的4～6葉齡心葉煙，每株挑選中上部大小相似3個葉片，采用3種施藥方式：1)先施藥，將提取物噴灑在煙葉片上，6h后用金剛砂摩擦接種病毒，以測定各提取物對感染TMV煙葉的保護作用;2)混合施藥，將不同提取物與病毒混合30min后用金剛砂接種病毒，測定提取物對TMV的體外鈍化作用;3)后施藥，用金剛砂接種病毒6h后在煙葉上噴施各稀釋后的提取物，以測定不同提取物對TMV的治療作用;左半葉噴施1mg/mL供試提取物作為試驗組，右半葉噴相同濃度的DMSO溶液作為對照組，將煙苗放在無蟲溫室中培養，3～4d后待枯斑癥狀明顯時，統計試驗結果，按以下公式計算抑制率。

　　采用葉圓片法測定提取物對TMV增殖抑制活性[12]。挑選長勢一致的健康普通煙，噴施1mg/mL提取物作為處理;噴施相同濃度的DMSO溶液作為對照;以800倍液寧南霉素為陽性對照藥。施藥24h后每株煙挑選一片中上部葉片摩擦接種TMV，接種TMV后48h打直徑為1cm的圓片，每片葉片取10個圓片于離心管，保存在-70℃冰箱，每個處理重復3次，以間接ELISA法檢測病毒含量。以噴施1mg/mLDMSO溶液，不接種TMV的煙苗作為健康對照[13]。

　　2、結果與分析

　　2.1提取物對煙草花葉病毒的抑制活性

　　先施藥結果(表2)表明，馬桑提取物對TMV的抑制活性最強(圖1a)，抑制率為53.64%，與陽性對照藥寧南霉素間無顯著差異;其次為銀膠菊，抑制率為46.51%;再次為黑蒿，抑制率為36.63%;銀膠菊與馬桑的活性差異不顯著，但顯著高于黑蒿、紫紅獐芽菜、大薊、小花鬼針草、忍冬、革命菜6種提取物的抑制率，對TMV侵染有一定保護作用。紫紅獐牙菜、大薊、小花鬼針草、忍冬、革命菜5種植物提取物對TMV侵染煙草也有一定的保護作用，抑制率介于10%～30%。其余19種植物提取物未顯示出保護活性。

　　表28種植物提取物對TMV的保護作用

　　注：數據為3次重復取平均值，提取物濃度為1mg/mL，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

　　施藥結果表明(表3),12種植物提取物對TMV侵染有治療作用，其中藿香薊提取物的治療效果(圖1b)最強抑制率為53.06%，與陽性對照寧南霉素的抑制率56.84%差異不顯著;此外天名精、青蒿、全葉馬蘭、馬桑4種提取物的治療活性也較好，抑制率介于40%～45%;紫紅獐牙菜、絡石、革命菜、角蒿、蕁麻、銀膠菊、牛尾蒿7種植物提取物對煙草花葉病毒也有一定治療作用，抑制率介于10%～40%;其余15種植物提取物對TMV無治療活性。

　　表312種植物提取物對TMV治療作用

　　2.2提取物對煙草花葉病毒的鈍化活性

　　混合施藥結果表明(表4),9種植物提取物對TMV有不同程度的鈍化活性，其中革命菜(圖1c)、蕁麻鈍化活性顯著，抑制率分別為62.20%和54.92%，與陽性對照寧南霉素無顯著差異;藿香薊和角蒿的抑制率分別為51.75%和40.81%，與革命菜、蕁麻的鈍化活性差異不顯著，但顯著低于寧南霉素;角蒿提取物對煙草花葉病毒的體外鈍化作用抑制率為40.81%，次于上述3種植物提取物;魚眼草、牛尾蒿、土木香、馬桑、女萎5種植物提取物對煙草花葉病毒的體外鈍化作用介于10%～40%;剩下的18種植物提取物均對煙草花葉病毒無體外鈍化活性。

　　圖1活體半葉枯斑法試驗結果

　　a.馬桑保護作用b.藿香薊治療作用c.革命菜鈍化作用左半葉為處理，右半葉為對照。

　　表49種提取物對TMV的鈍化作用

　　2.3提取物對煙草花葉病毒的增殖活性

　　病毒衣殼蛋白(CP)是病毒在寄主體內移動的標記，病毒在寄主體內的增殖可以通過病毒衣殼蛋白在寄主體內的積累量來表現[12]。本研究采用普通煙葉圓片法結合間接ELISA法檢測了經27種植物提取物處理后普通煙葉圓片中煙草花葉病毒蛋白衣殼的累積情況，檢測結果見圖2。與對照相比除大薊、小花鬼針草、金腰箭、香青蘭、馬桑5種提取物外，其余22種提取物對TMV增殖均有一定的抑制活性。其中革命菜、藿香薊、絡石、老鸛草、角蒿5種提取物與寧南霉素無顯著差異，表明這些提取物抑制TMV增殖的活性相當于陽性藥劑寧南霉素;牛尾蒿、土木香、千里光、魚眼草、天名精、黑蒿、茵陳蒿、全葉馬蘭、銀膠菊、青蒿、細葉山紫蘇、蕁麻、紫紅獐牙菜、女萎、忍冬15種提取物對TMV增殖的抑制活性顯著高于寧南霉素;其中香絲草提取物和水麻提取物處理組TMV含量與健康煙葉無差異，表明上述2種提取物能完全抑制TMV在烤煙K326體內的增殖，說明提取物中含有顯著抑制病毒增殖的活性物質，值得深入研究。

　　圖2提取物間接ELISA檢測結果

　　H為健康葉片;N為DMSO處理的對照;P為寧南霉素處理的陽性對照。

　　3、結論與討論

　　煙草花葉病毒在農作物上是危害極為嚴重的侵染性病毒，其寄主范圍廣、防治難、危害大，給農業上帶來極大的經濟損失[14]。煙草花葉病毒一般以粒子形式存在，當煙草花葉病毒粒子侵入寄主后，病毒粒子的核酸和寄主的核糖體結合在一起，病毒借助寄主植物的代謝來復制自身蛋白，從寄主獲取營養的同時也破壞了寄主組織細胞。當病毒侵入寄主后，與寄主融為一體后，很難做到在不傷害寄主的前提下殺死病毒[15]。植物源抗病毒制劑由于毒副作用小，資源豐富，無殘留，高效的優勢，在植物病毒病害防治過程中表現出重要的潛在價值[16]。

　　自1914年Allard首次發現商陸中存在抗病毒活性物質后[17]，有關植物源抗TMV活性物質的研究在逐漸增加，提取到相關的抗TMV活性植物小分子結構有單寧、苦木素、生物堿等[18]。本試驗研究了27種植物不同部分提取物的抗煙草花葉病毒活性。抑制作用研究結果表明，其中有8種植物的提取物對TMV侵染煙草具有一定的保護作用，12種植物的提取物具有不同程度的治療作用，9種植物的提取物具有直接鈍化作用，說明不同種類的植物具有不同的抗病毒作用方式。其中抑制TMV侵染活性顯著的提取物有馬桑、革命菜、蕁麻和藿香薊，其中馬桑提取物僅具有良好的保護活性，而后3種植物提取物同時具有鈍化和治療作用。上述幾種提取物的抗病毒活性顯著，有必要進一步研究其中的抗TMV活性物質。其中革命菜和藿香薊為入侵植物，危害生態環境，如能開發利用將有效推動它們的綜合治理[19]。篩選的27種植物中有一些是沒有抑制活性的，其提取物處理組的枯斑數比對照組枯斑數量多，表明這些提取物有利于病毒的侵染，可能含有協同TMV侵染的成分，陳啟建等研究有少數植物提取物對TMV侵染有促進作用[20]。

　　植物病毒為專性寄生，若不能有效識別并侵染寄主，病毒無法復制基因組在寄主細胞內增殖。病毒與寄主間的相互作用在病毒的繁殖和系統侵染中起到至關重要作用[21]。有效的植物抗病毒物質可以直接靶向病毒核酸或蛋白來抑制病毒，或者調節寄主反應(植物激素表達，各種信號轉導)來間接抑制病毒，進而影響病毒與寄主間的平衡[22]。

　　植物提取物中的蛋白質類成分與煙草花葉病毒的病毒外殼蛋白相似，能與病毒爭奪寄主上的結合位點;另一類成分(單寧)可以和病毒外殼蛋白結合，形成病毒復合物，病毒外殼蛋白降低對侵染位點的識別能力，使病毒喪失侵染性[23,24]。本研究的植物提取物馬桑、革命菜、蕁麻和藿香薊，具有顯著的抑制病毒侵染活性，可能提取物中含有大量此類物質，影響了病毒外殼蛋白對寄主侵染位點的識別能力，抑制病毒的侵染。

　　植物提取物可以斷裂、凝聚侵入寄主的病毒粒子，使病毒失去增殖能力[25]。本研究發現，27種提取物中有22種提取物能抑制TMV在烤煙K326中增殖，其中水麻提取物和香絲草提取物的OD405值接近健康葉片對照，說明其抑制TMV增殖的作用效果最強。表明水麻和香絲草對普通煙K326內的病毒增殖具有顯著的抑制作用，并且明顯高于陽性對照藥劑寧南霉素。寧南霉素是目前研究較充分的植物病毒抑制劑，它可以和病毒外殼蛋白相互作用，并抑制TMV病毒粒子的聚合，使病毒不能復制[26]。另一主要作用機制是誘導寄主的防衛反應，誘導寄主防御反應是控制病毒的一種非常有效且對環境安全的方式[27]。病原相關分子模式觸發的免疫反應(PTI)是由寄主識別受體(PRRs)感知病毒誘導的重要防御反應[28]。寧南霉素能增強保守的寄主識別受體FLS2和RLK1對病毒的感知，有效激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，轉導信號最終激活植物中的各種WRKY轉錄因子，積極調節PTI途徑來有效抑制TMV[29,30]。同時，寧南霉素能增強水楊酸(SA)信號響應相關基因病程相關基因非表達子1(NPR1)的表達，進而促進轉錄因子WP-KY70表達，作用于SA響應基因。同時轉錄因子WPKY70的高表達，抑制了茉莉酸(JA)響應基因的表達[30,31]。SA信號轉導與JA信號轉導同時作用，使寄主產生防御反應，抑制TMV。此外，寧南霉素還參與RNA沉默。其能促進鈣調素類似蛋白CML46表達，使CML46與RNA沉默抑制因子RNA依賴性RNA聚合酶RDR1結合并降解，調節RNA沉默相關基因的表達，抑制TMV的復制[30,32,33]。

　　植物提取物能誘導寄主的病程相關蛋白(PR)，誘導寄主防御反應，提高煙草對TMV的抗性[24];還能增強過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶活性，使清除TMV侵染寄主產生的超氧陰離子自由基和羥基自由基能力增強，進而抑制TMV[24]。另外，植物提取物能干擾病毒外殼蛋白與病毒核酸的裝配，影響病毒有效的在寄主體內長距離的傳播[24]。水麻、香絲草提取物對TMV增殖的顯著抑制活性表明，提取物中可能含有能有效的靶向病毒核酸或蛋白，能誘導煙草病程相關蛋白、調節植物激素表達、PTI途徑等活性成分，進而誘導寄主防御反應，抑制TMV的增殖。詳細抑制TMV的機理有待進一步研究。本研究以不同植物為研究對象，擴大抗TMV活性物質研究范圍，為今后的生物制劑的開發提供一定基礎。

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