生鮮面優勢腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析

　　摘 要：為研究生鮮面優勢腐敗菌及致腐能力大小，通過形態學鑒定篩選優勢腐敗菌，再利用生理生化手段和 16S rDNA 序列分析法手段進行優勢腐敗菌鑒定。以感官評分、酸度、 pH 和菌落總數為評價指標，確定優勢腐敗菌的致腐能力大小。鑒定結果表明：引起生鮮面腐敗的主要腐敗菌為細菌，經生理生化鑒定和 16S rDNA 序列鑒定可知優勢腐敗菌分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。致腐能力結果表明：通過對不同貯藏時間生鮮面的感官評分、酸度、pH 和菌落總數進行綜合評價，發現 3 株優勢腐敗菌的致腐能力：枯草芽孢桿菌>蠟狀芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌。

　　本文源自保鮮與加工 發表時間：2021-02-23《保鮮與加工》雜志是由國家農產品保鮮工程技術研究中心主辦的全國唯一以農產品保鮮與加工為主要內容的技術類科技期刊，也是中國農產品保鮮工程協會、中國農學會貯藏加工分會、中國園藝學會采后科學技術分會會刊，2000年創刊。十年來，我們始終堅持辦刊宗旨，全面推行以質量為中心的辦刊機制，追蹤國際同類研究發展前沿，以市場為導向，主要設置了專家論壇、保鮮研究、加工研究、專題論述、技術指南、科技前沿、政策法規、行業資訊、科普沙龍等欄目，突出理論與實踐相結合，提高學術水平與科技普及技術指導兼顧的特色，每年按期發行期刊6期，共計3萬冊，遍及全國除港澳臺外的31個省市自治區，為我國農產品保鮮與加工行業的技術進步及其相關技術產品產業化開發和科技普及起到了積極的促進作用。

　　關鍵詞：生鮮面;優勢腐敗菌;分離;鑒定;致腐能力

　　面條作為我國人們的傳統主食之一，有著悠久的歷史，且制作便捷，含有豐富的維生素、碳水化合物、蛋白質，和微量元素[1-2]。面條主要分為生鮮面、掛面、方便面等，其中生鮮面由于即做即食，口感筋道爽滑，頗受人們的喜愛，在我國占據很大的消費市場。隨著我國食品工業的發展，以及人們對食物越來越高的要求，對生鮮面的保水性、保存性、不宜腐敗性等提出了更高的要求。但由于生鮮面本身含水量高，容易因微生物的滋生而腐敗變質，從而造成原料的大量浪費和高昂的運輸成本[3-5]。因此，如何防止微生物對生鮮面品質的損壞是提高生鮮面品質和降低貯藏成本的重要研究方向之一。

　　目前，國內外對生鮮面中的腐敗菌有一定的研究報道。許玉慧等[6]在對即食濕面條的腐敗微生物的分離中得出，導致濕面條腐敗變質的微生物為細菌，其主要為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌。周其中[7]在生鮮濕面保藏技術的研究中發現導致腐敗的主要微生物為細菌和霉菌，另外也鑒定出了 7 個霉菌屬。黃斌等[8]對生鮮面進行了危害分析和關鍵環節控制點的研究，同時進行危害分析并建立關鍵控制點。劉增貴等[9]的研究表明，生鮮面條在 30 ℃儲藏條件下，微生物迅速增殖，面條顏色逐漸變黃，得出微生物是造成面條劣變的重要因素。但目前對即食濕面條中腐敗微生物的相關研究報道相對較少，李昌文等[10]對即食濕面條的保鮮進行了研究，但未對腐敗微生物進行分離鑒定，而李運通等[11]指出細菌是導致高水分面制品腐敗的主要微生物，會產生復雜的物化反應，從而導致面條品質變質。

　　本研究通過形態學鑒定篩選生鮮面中的優勢腐敗菌，再利用生理生化手段和 16S rDNA 序列分析法手段對生鮮面中的優勢腐敗菌進行鑒定。同時，以感官評分、酸度、pH 和菌落總數為評價指標，綜合評價優勢腐敗菌對不同貯藏時間生鮮面的致腐能力，為生鮮面的工業化生產、商品流通等提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　小麥粉：金龍魚高筋麥芯粉;食用鹽：河南省衛群多品種鹽有限公司;三氯甲烷、氯化鈉、革蘭氏染劑、氫氧化鈉、丙酮、30%過氧化氫溶液、V-P 試劑、硝酸鹽、吲哚、營養瓊脂培養基、平板計數瓊脂培養基、孟加拉紅培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

　　1.2 儀器與設備

　　YP-N 型電子分析天平，上海精密儀器儀表有限公司;超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;SPX-250B-Z 型生化培養箱、SW-CJ-1BU 超凈工作臺，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;PHS 25 型 pH 計，上海雷磁儀器廠;WD-9413B 型凝膠成像分析系統，北京六一生物科技有限公司;DNA 提取試劑盒，西安擎科創新生物科技有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 生鮮面的制作

　　面粉、食鹽、水(質量比 100︰1︰39)→和面(慢速檔攪拌 5 min，中速檔攪拌 2 min)→熟化(室溫靜置 15 min)→壓延(在壓輥間距 2、1.8、1.6、1.4 mm 處各對折壓片 5 次，形成厚度為 1.4 mm 的面片)→切條→脫水(120 ℃烘干 1 min)→裝袋

　　1.3.2 生鮮面的腐敗處理

　　將無菌生鮮面在 25 ℃條件下進行儲藏，直至腐敗變質。

　　1.3.3 微生物計數

　　菌落總數測定：參照 GB/T 4789.2—2016 《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 菌落總數測定》;霉菌及酵母菌測定：參照 GB/T 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》。

　　1.3.4 生鮮面腐敗菌的分離純化

　　在無菌操作環境下，稱取已腐敗生鮮面樣品 1 g，放入已滅過菌的研缽中，把生鮮面研碎加入 9 mL 無菌水后再次進行充分研磨，隨后取 1 mL 生鮮面的懸濁液進行 10 倍系列梯度稀釋，選擇 4 個合適的稀釋度各吸取 1 mL 涂布平板到營養瓊脂培養基上，每個濃度下設3 個平行實驗，同時做好空白對照。及時將涂布完成的培養基倒平板同時放入 37 ℃的生化培養箱中培養 48 h±2 h。待培養基上的細菌長出，觀察培養基表面的菌落生長狀況，確定其優勢腐敗菌，做好標記。將分離出的菌落平板劃線，反復分離純化，進行低溫保藏待用。

　　1.3.5 優勢腐敗菌的鑒定

　　1.3.5.1 生理生化鑒定

　　參考《常見細菌系統鑒定手冊》采取菌落觀察等方法對實驗中分離得到的菌株進行初步鑒定;通過硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶、葡萄糖、甘露醇、木糖發酵實驗、V-P 實驗、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、吲哚實驗、耐鹽性實驗、耐熱性等生化鑒定實驗對分離的菌株進行生化鑒定。

　　1.3.5.2 分子生物學鑒定

　　選取在適宜條件下培養了 24 h 左右的腐敗菌制成菌懸液，10 000 r/min 離心 10 min 后棄去上清液，然后加入 100 μL ddH2O 制得模板 DNA。PCR 擴增反應體系包括: 模板 DNA 2 μL，引物 27 F 1 μL，引物 1541R 1 μL，Taq PCR Master Mix(2×)25 μL，ddH2O 補至 50 μL。 PCR 反應條件：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性 60 s，58 ℃復性 60 s，72 ℃延伸 90 s，共 30 個循環;72 ℃延伸 5 min;4 ℃保存。取 5 μL PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，隨后將擴增產物在西安擎科生物技術有限公司進行測序鑒定，并登錄 NCBI 網站，與數據庫已知序列進行比對，獲得相似性較高的菌株序列，使用 MEGA 5.0 軟件，構建系統發育樹。

　　1.3.6 生鮮面腐敗菌的腐敗能力測定

　　生鮮面經包裝密封后紫外殺菌，得到無菌生鮮面。首先，將分離出的供試優勢菌接種于營養瓊脂培養基中后放入生化培養箱中于 37 ℃下培養 48 h，無菌操作下將接種環于酒精燈下充分灼燒后分別挑取一定量幾種菌株并加入 225 mL 的無菌水，適當的調整菌懸液濃度，每挑一次菌都要將接種環進行充分的灼燒以防混入雜菌。接著，分別將無菌生鮮面置于供試菌株菌懸液以及無菌水中浸泡 30 s 后拿出，用無菌包裝密封袋重新包裝后即為接種處理過的生鮮面，同時以無菌水浸泡 30 s 并以無菌包裝的生鮮面為空白對照。最后，將所有樣品放回入恒溫箱中 25 ℃密封保存。每隔 6 h 定時取樣，對采集的樣品進行感官評價、酸度值、 pH 值和菌落總數等理化指標的測定，以評價幾種不同的菌株對生鮮面的致腐能力。

　　1.3.6.1 生鮮面菌落總數測定

　　參照 1.3.3 微生物計數中的菌落總數測定。

　　1.3.6.2 生鮮面 pH 的測定

　　參照 GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品 pH 值的測定》進行測定。

　　1.3.6.3 生鮮面酸度值的測定

　　參照 GB5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度值的測定》進行測定。

　　1.3.7 生鮮面的感官評價

　　通過查閱任順成等[12]和張婉[13]的面條感官評分標準。由感官評價小組(5 位經過專業培訓的人員組成)對生鮮面的質地、色澤、氣味、是否酸敗等指標進行評價。感官評價采用 10 分制，當評分低于 5 分(包括 5 分)時，生鮮面若出現酸味或霉變，即不能食用。評價指標體現見表 1。

　　1.3.8 數據處理

　　數據采用 3 次平行試驗的平均值，結果用平均值±標準偏差表示。采用 Origin 8.0 軟件進行繪制數據圖。使用 MEGA 5.0 軟件構建系統發育樹。

　　2 結果與分析

　　2.1 生鮮面微生物計數

　　將腐敗的面條接種在營養瓊脂培養基、孟加拉紅培養基上，經培養后，各培養基的生長情況如表 2 所示。

　　由表 2 可知，營養瓊脂培養基上生長出較多適宜細菌的微生物，大大超過了 NY/T 1512-2007《綠色食品 生面食、米粉制品》[14]中生面食菌落總數應≤3×105 CFU/g 的要求。孟加拉紅培養基作為主要培養霉菌、酵母菌的培養基上幾乎沒有微生物，由此可知導致生鮮面腐敗的優勢腐敗微生物主要是細菌。可見，細菌是導致生鮮面腐敗的主要因素，主要是由于生鮮面含水量較高，營養豐富，環境適宜菌群生長較快，最終導致貨架期較短。

　　2.2 優勢腐敗菌的分離和篩選

　　2.2.1 各種腐敗菌落特征及比例

　　圖 1 為 1、2、3 號菌的菌落特征圖，表 3 為各種腐敗菌落的特征及比例。由表 3 可知， 1 號菌在培養基中的比例為 39.25%，2 號菌為 30.45%，3 號菌為 21.34%，三株菌占所有腐敗菌的 91.04%，表明這三株菌為生面條中主要的優勢腐敗菌。

　　各腐敗菌菌株的生理生化特征如表 4 所示，由表 4 結果與系統手冊初步對比可知，DX 為枯草芽孢桿菌、DY 為地衣芽孢桿菌、DZ 為蠟狀芽孢桿菌，后續還需進行 16S rDNA 序列鑒定以進一步確定。

　　2.2.2 16S rDNA 序列測定

　　將分離得到的 3 株優勢菌種 DX、DY、DZ，進行 16S rDNA 測序鑒定。以 3 株優勢腐敗菌株的 DNA 為模板，進行 PCR 擴增，并做凝膠電泳檢測。

　　3 株優勢菌株 16S rDNA 的 PCR 擴增電泳圖譜如圖 2 所示。由圖 2 可見，擴增產物在 1 500 bp 附近可見清晰明亮條帶。將 PCR 產物送至西安擎科生物技術有限公司進行測序，將測序結果在 NCBI 中比對，獲得相似性較高的菌株序列，使用 MEGA5.0 軟件，構建系統發育樹。

　　3 株優勢菌株的 16S rDNA 序列同源性系統發育樹如圖 3 所示。由圖 3 可知，所有序列與已知的同源性均在 97%以上，說明鑒定結果可靠。經分子鑒定后，3 株菌株分別為：DX 為枯草芽孢桿菌、DY 為地衣芽孢桿菌、DZ 為蠟狀芽孢桿菌。

　　2.3 優勢致腐對生鮮面品質的影響

　　將優勢腐敗菌接種在新鮮的生鮮面上，來探究不同貯藏時間(0、6、12、18、24、30)對生鮮面品質的影響。

　　2.3.1 在不同貯藏條件下腐敗菌對感官評分的影響

　　感官評價法目前是食品品質評價的主要方法[15~16]。在 25 ℃貯藏條件下接種腐敗菌的生鮮面感官評分的變化趨勢如圖 4 所示。由圖 4 可知，在貯藏期間，感官評分起始為 9.10 分，隨著貯藏時間的增加，總體都呈下降趨勢，在貯藏 12 h 后面條外觀明顯變暗，面條質地發黏，伴隨有腐爛變質的氣味，在貯藏 30 h 時感官評分達到最低，且不同微生物對生鮮面感官評價的影響程度是不同的。同時，隨著貯藏時間的延長，感官評價下降的程度越來越顯著，其中接種 DX 的生鮮面的變質程度最為顯著，在貯藏 30 h 時感官評價達到最小值，即 4.20分，其次是 DZ 和 DY，最小值分別為 4.50 分和 5.10 分，這與趙宏強等[17]研究的冷藏鱸魚片中優勢腐敗菌的感官評分變化趨勢基本一致。這主要是由于不同微生物的生長速度和致腐能力不同，進而造成生鮮面的腐敗程度也不同。接種不同微生物的生鮮面之間呈現顯著性差異(P<0.05)。

　　2.3.2 在不同貯藏條件下腐敗菌對生鮮面酸度的影響

　　酸度的變化是判斷生鮮面腐敗變質的重要因素。在 25 ℃貯藏條件下接種腐敗菌的生鮮面酸度的變化趨勢如圖 5 所示。由圖 5 可知，在貯藏期間，酸度起始為 0.80 mL/10 g，隨著貯藏時間的增加，三種生鮮面的酸度總體都逐漸上升，在貯藏 18 h 時，酸度上升略微平緩，在貯藏 30 h 時達到最大值。接種不同微生物的生鮮面酸度值之間呈顯著性差異(P<0.05)。在接種的三株優勢菌株中，DX 的酸度值最大，在貯藏 30 h 時達到最大值，即 4.46 mL/10 g，其次是 DZ 和 DY，酸度值分別達 3.90 mL/10 g 和 3.70 mL/10 g。空白組的酸度值整體低于接種優勢菌株的樣品組的酸度值。Li M 等[18]研究表明，酸度與微生物的增長有顯著的正相關關系，主要是由于在貯藏過程中，微生物的生長代謝產物會造成生鮮面酸敗。

　　2.3.3 在不同貯藏條件下腐敗菌對生鮮面 pH 的影響

　　pH 的變化是判斷生鮮面腐敗變質的關鍵因素。25℃貯藏條件下接種腐敗菌的生鮮面 pH 的變化趨勢如圖 6 所示。由圖 6 可知，在貯藏期間，pH 起始為 6.72，隨著貯藏時間的增加，接種 DX、DY 和 DZ 優勢腐敗菌的生鮮面的 pH 值都逐漸降低，在貯藏 18 h 時，pH 值下降略微平緩，在貯藏 30 h 時 pH 值達到最小值。剛制備出的生鮮面的 pH 在 6.50 附近，此條件下非常適合微生物的生長[19];隨著貯藏時間的延長，接種 DX 菌的生鮮面的 pH 下降速率最快，在貯藏 30 h 時達到最小值，即 pH=5.07，其次是 DZ，最后是 DY，pH 分別為 5.24 和 5.58。此外，未接種腐敗菌的空白組的 pH 都略高于其他三種，三株優勢腐敗菌之間對生鮮面的影響呈顯著性差異(P<0.05)。引起生鮮面 pH 值下降的主要原因在于在貯藏期間由于微生物的大量繁殖，使得生鮮面中的淀粉等碳水化合物被充分利用，產生了大量的有機酸等酸性底物和代謝底物，使得生鮮面的 pH 不斷下降[20]。

　　2.3.4 在不同貯藏條件下腐敗菌對生鮮面菌落總數的影響

　　微生物的生長繁殖所產生的代謝底物是引起生鮮面腐敗變質的主要原因之一。其最明顯的特征就是生鮮面中菌落總數的變化，是品質變化的指標之一[21~22]。在 25 ℃貯藏條件下接種腐敗菌的生鮮面菌落總數的變化趨勢如圖 7 所示。由圖 7 可知，在貯藏期間，菌落總數起始為 2.86 lg(CFU·g -1 )，隨著貯藏時間的增加，菌落總數總體都呈現上升的趨勢，其中接種 DX 菌的變化最為顯著，在貯藏 30 h 時達到最大值，即 7.77 lg(CFU·g -1 )，高于其他三組，其次是 DZ，最后是 DY，菌落總數最大值分別為 6.78 lg(CFU·g -1 )和 6.62 lg(CFU·g -1 )，這與高磊等[23]研究的冷鮮雞腿肉中優勢腐敗菌的菌落總數變化趨勢基本一致。其中造成三組不同的主要原因可能是由于每種微生物的生長代謝速度和致腐機制的不同，造成菌落總數不同，其結果與微生物對生鮮面的感官評分、酸度以及 pH 的影響大致相同，造成了生鮮面品質的劣變。不同菌株的生長情況會隨著貯藏時間呈現顯著差異(P<0.05)，貯藏后期因為酸類、胺類等代謝產物的逐漸增多，又會反過來抑制微生物的生長[24]。

　　3 結論

　　本試驗通過形態學鑒定篩選出生鮮面中的優勢腐敗菌，再借助生理生化手段和 16S rDNA 序列分析法手段對菌群中占比較高且致腐能力較強的優勢腐敗菌進行鑒定，鑒定結果表明 3 株優勢腐敗菌分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。同時，將鑒定出的 3 株優勢腐敗菌回接到生鮮面中，以不同貯藏時間生鮮面的感官評分、酸度、pH 和菌落總數為指標，綜合評價優勢腐敗菌對生鮮面致腐能力的大小。結果表明 3 株優勢腐敗菌的致腐能力：枯草芽孢桿菌>蠟狀芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌。這為生鮮面的保鮮貯藏提供了理論依據，也為生鮮面產業化遠距離運輸降低運輸費用提供了參考。