代謝工程改造嘌呤合成途徑以提高核黃素產量

　　摘要 核黃素(riboflavin)又名維生素 B2，是人體必不可少的營養物質之一，而鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)則是核黃素合成的重要前體。為在高產菌株的基礎上進一步提高核黃素產量，該研究以高產核黃素的枯草芽孢桿菌 S1 為出發菌株，利用 CRISPER/Cas9 介導的基因組堿基編輯技術對嘌呤合成途徑阻遏蛋白基因以及 GMP 還原酶基因進行失活，并利用質粒過表達的方法進行了一系列的代謝工程改造。結果顯示，guaC 基因的失活阻斷了 GMP 到 IMP 的回補途徑，使 GMP 得到積累，使核黃素產量達到 3.04 g/L，而 purR 基因的失活沒有效果;使用 PvegI 啟動子過表達希瓦氏菌來源的 ribA 后，核黃素產量提高到 3.33 g/L。將失活 guaC 基因與 PvegI 啟動子過表達希瓦氏菌 ribA 結合，最終使核黃素產量達到 3.43 g/L，較出發菌株核黃素產量提升 22%，轉化率提升 25.8%。

　　關鍵詞 核黃素;鳥苷三磷酸;枯草芽孢桿菌;堿基編輯器;過表達;代謝工程改造

　　谷振宇; 夏苗苗; 蘇媛; 劉川; 羅華軍; 張大偉 食品與發酵工業 2022-01-18

　　核黃素，又名維生素 B2，是人和哺乳動物生長必不可少的一種營養物質，在生物體內參與多種氧化還原反應，尤其在作為黃素酶類的輔酶參與細胞中傳遞氫的相關代謝中起到了重要的作用[1]。比如，核黃素轉化為活性形式：黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)可以參與促進生物體內碳水化合物的合成、脂肪酸代謝以及呼吸電子鏈傳遞[2]。由于哺乳動物自身不能合成核黃素，因而其在飼料行業、食品醫藥行業中都著有廣泛的應用[3-4]。

　　鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)是核黃素生物合成的直接前體[5]，它既可以以糖和氨基酸為底料進行從頭合成，也可以利用嘌呤堿為前體進行補救合成。嘌呤從頭合成途徑將戊糖磷酸途徑生成的 5-磷酸核糖(ribose 5-phosphate，R5P)最終轉化成 GTP 和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。以合成 GTP 為例，其主要可以分為嘌呤操縱子催化 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5- phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)生成肌苷酸(inosincacid,inosinemonphosphate，IMP)，以及 IMP 催化生成 GTP 兩個階段。根據文獻報道，發酵過程中添加 GTP 可以提高核黃素產量[6-7]，證明嘌呤前體的有效供應對核黃素的生產至關重要。并且利用代謝工程策略增強 GTP 的合成也已有很多報道[8-10]。

　　本文選用的核黃素高產菌株 S1 在 5 L 發酵罐中發酵 52 h，核黃素產量可達 27 g/L。本研究在此基礎上利用基于 CRISPR-Cas9 的堿基編輯器失活嘌呤操縱子阻遏蛋白基因以及 GMP 還原酶來分別提高 GTP 合成中 2 個階段的通量。另一方面嘗試過表達 GMP 到 2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)嘧啶-4(3H)酮(DARPP)合成途徑的基因以增強 GTP 的合成，最終結果表明 2 種方法的組合使核黃素產量有較大的提升。

　　1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 實驗菌株與質粒

　　論文中涉及的菌株見表 1-1，質粒見表 1-2。

　　1.1.2 主要培養基

　　LB 培養基：酵母提取物 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl 1%;滅菌前用 NaOH 調節 pH 值至 7.2， 121 ℃滅菌 20 min。 SX 培養基：酵母提取物 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl 0.5%;滅菌前用 NaOH 調節 pH 值至 7.2， 121 ℃滅菌 20 min。發酵培養基 YP：玉米漿干粉 0.5%，蔗糖 1%、硫酸鎂 0.5%，酵母抽提物 0.5%，磷酸氫二鉀 0.3%，磷酸二氫鉀(0.2%)，滅菌前用 NaOH 調節 pH 值至 7.2，121 ℃滅菌 20 min。補料培養基：一水葡萄糖 72%，玉米漿干粉 1.5%，磷酸二氫鉀 0.030%，滅菌前用 NaOH 調節 pH 值至 7.2。115 ℃滅菌 30 min。

　　1.1.3 儀器與設備

　　GET3XG 三槽獨立梯度基因擴增儀，杭州柏恒科技有限公司;水平電泳儀，北京市六一儀器廠; 94-Z 水平搖床，寧波新芝生物科技股份有限公司;V-1600 可見分光光度儀，上海美譜達儀器有限公司;SBA-40E 生物傳感分析儀，山東生物傳感器重點實驗室。

　　1.2 方法 1.2.1 嘌呤合成途徑基因過表達及失活菌株構建方法

　　本實驗所涉及的基因序列均來自 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用 SnapGene 設計所用引物，由金唯智生物公司合成(表 2)。

　　1.2.2 嘌呤合成途徑基因過表達及失活菌株的構建 1.2.2.1 質粒構建

　　以 SG 質粒為例，以 pHP13-spe-PvegI-mcherry 質粒為模板，用引物 pHP131、PvegI-2 擴增含壯觀霉素抗性基因以及 PvegI 啟動子的 pHP13 質粒骨架，以 B. subtilis 168 基因組為模板，用引物 UPgmk、DN-gmk 擴增 gmk 基因片段，將擴增出來的 2 個片段用 Gibson 試劑盒兩片段連接，化學轉化 DH5α 后，挑取長出的菌落用 CXPHP131、CXPHP132 引物進行驗證，正確的轉化子大小為 1 293 bp，驗證且測序正確后接入無抗的 LB 培養基中培養 14~17 h 提取質粒。

　　1.2.2.2 嘌呤合成途徑基因過表達

　　向目的菌株中用電轉化[11]的方法轉入相應基因的過表達質粒，以終質量濃度為 150 µg/mL 的壯觀霉素進行篩選獲得正確的轉化子后保藏。

　　1.2.2.3 堿基編輯器質粒的構建及嘌呤合成途徑基因失活

　　堿基編輯器失活 guaC 和 purR 的質粒基于實驗室中構建的堿基編輯器質粒 pHP13-spe-dcas9。質粒以 pHP13 為骨架包含復制起始位點 Puc ori，復制蛋白 Pep pTA1060，壯觀霉素抗性基因 spe。其余部分包括乳糖/IPTG 誘導的阻遏蛋白基因 lacI，PgraC 啟動子表達 dcas9 及脫氨酶(adenosine deaminase，AID)，其中 dcas9 缺失終止密碼子，PvegI 啟動子連接僅缺少 N20 的向導 RNA。在插入 N20 序列時，首先需要找到相應基因序列前中段合適的 NGG 序列，NGG 序列上游 20 bp 為 N20 序列，由于在 NGG 上游 15~20 bp 更容易利用堿基編輯器發生編輯，所以在 NGG 上游 15~20 bp 尋找使 C 變為 T 而產生終止密碼子的突變，設計 N20 以構建質粒。以 PDC 質粒為例，以 pHP13-spe-dcas9 質粒為模板，用引物 UP-dcas9-guaC、DN-dacs9 擴增片段 1，用引物 UP-dac9、DN-dcas9-guaC 擴增片段 2，將擴增出來的 2 個片段用 Gibson 試劑盒兩片段連接，化學轉化 DH5α 后，挑取長出的菌落用CX13spe2、CXJF2 引物進行驗證，正確的轉化子大小為 624 bp，驗證且測序正確后接入無抗的 LB 培養基中培養 14~17 h 后提取質粒。向目的菌株中用電轉化的方法轉入相應基因的堿基編輯器質粒，以終質量濃度為 150 µg/mL 的壯觀霉素進行篩選獲得正確的轉化子后，進行傳代培養使目的位點發生編輯并且使質粒丟失，影印后對質粒丟失的菌進行測序，得到相應密碼子突變成終止密碼子的菌株進行保藏。

　　1.2.3 核黃素濃度的測定

　　取 500 µL 發酵液樣品于 1.5 mL EP 管中，用 0.1 mol/L NaOH 溶液稀釋適宜倍數，避光堿溶 20 min 取出，12 000 r/min 離心 1 min，取上清液用分光光度計檢測 444 nm 處的吸光度值，以確定核黃素的濃度[12]。

　　1.2.4 殘糖測定

　　取 500 µL 發酵液樣品于 1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心 1 min，取上清液用無菌水稀釋適宜倍數后，用進樣針取樣，用生物傳感分析儀對樣品的殘糖進行檢測。

　　1.2.5 蔗糖測定

　　取 200 µL 發酵液樣品于 1.5 mL EP 管中，加入 200 µL 配置好的 2 mol/L H2SO4溶液，于 60 ℃水浴鍋中水解 30 min，加入 4 mol/L NaOH 溶液 200 µL 進行中和，12 000 r/min 離心 1 min，取上清液用無菌水稀釋適宜倍數，用生物傳感分析儀對樣品水解后的葡萄糖進行檢測，蔗糖的濃度為測得的葡萄糖濃度的 2 倍。

　　1.2.6 搖瓶補料發酵驗證

　　從﹣80 ℃凍存管中取 3 µL 菌液于含有 1 mL 無菌水的 EP 管中，10 倍稀釋后混勻，取 3 µL 涂布 SX 平板，37 ℃倒置培養 48 h，挑取直徑 5~6 mm 的 1 個單菌落接種 2 支固體試管 SX 含相應抗性的斜面培養基，37 ℃靜置培養 48 h。用 1 mL YP 培養基清洗下 1 支斜面上的所有菌苔于 2 mL EP 管中，混勻，取 300 µL 菌液分別接種于含有 80 mL YP 培養基的 500 mL 瓶底有擋板的三角瓶中， 37 ℃，180 r/min 振蕩培養 41 h。培養過程中分別在 11 和 23 h 加入補料培養基進行補料發酵。

　　2 結果與分析 2.1 嘌呤合成途徑基因失活及補料發酵驗證

　　根據文獻報道，purR 基因編碼嘌呤合成途徑的阻遏蛋白 PurR，敲除 purR 基因可使嘌呤合成途徑基因轉錄水平大幅提升[13-14]：guaC 基因為嘌呤合成途徑 GMP 還原酶編碼基因，敲除 guaC 基因[15]可阻斷 GMP 到 IMP 的合成，從而使 GMP 得到一定的積累，間接提高核黃素的產量。因此對這 2 個基因用 CRISPER/Cas9 介導的基因組堿基編輯器技術進行失活[16-17]，分別得到菌株 SDR 和 SDC，并對這 2 個菌株進行補料發酵驗證。

　　由圖 2-2 可知，嘌呤合成途徑的阻遏蛋白 purR 堿基編輯器失活后產量從 2.81 g/L 降至 2.68 g/L，證明高產菌 S1 中嘌呤合成途徑由 PRPP 到 IMP 部分基因轉錄水平足夠滿足核黃素的合成，不是該途徑中的限速步驟;而嘌呤合成途徑的回補途徑基因 guaC 堿基編輯器失活后，阻斷了 GMP 到 IMP 的合成，產量由 2.81 g/L 提升至 3.04 g/L，產量提升 8%。41 h 時 S1 菌以及 SDR 菌葡萄糖有少量剩余， SDC 菌葡萄糖剩余 2.67 g/L(圖 2-3)，17 h 時搖瓶內蔗糖已耗盡。SDC 菌株核黃素轉化率由 S1 菌株 1 g 糖(0.392 g 蔗糖、0.608 g 葡萄糖)產 0.027 5 g 核黃素提高至 1 g 糖(0.399 g 蔗糖、0.601 g 葡萄糖)產 0.030 3 g 核黃素，轉化率提升 10.2%。

　　2.2 嘌呤合成途徑基因過表達

　　以上實驗表明 guaC 基因失活使產量有所增加，推測 GMP 的供給并沒有達到飽和。基于此推論，嘗試了將 gmk 和 ndk 基因進行過表達(gmk 編碼鳥苷酸激酶，催化 GMP 生成 GDP，ndk 編碼核苷二磷酸激酶，催化 GDP 生成 GTP)，期望通過增加 GMP 的消耗拉動 IMP 向 GMP 的轉化過程。因此對這 2 個基因以 pHP13 為質粒骨架，PvegI 為啟動子構建質粒 PG 和 PN，電轉化進 S1 菌株，分別得到菌株 SG 和 SN，并且用攜帶不含啟動子及目的基因的空載質粒 S1-空菌株作為對照，進行補料發酵驗證。

　　由圖 3-1 可知，過表達 gmk 及 ndk 后對菌株生長無明顯影響。圖 3-2 為核黃素終產量，與對照菌株 S1-空相比，SG 菌株及 SN 菌株產量無明顯提高，41 h 時葡萄糖無剩余(圖 3-3)，17 h 時搖瓶內蔗糖已耗盡。這說明單獨表達這 2 個基因并沒有拉動 GMP 的合成，而 GTP 進入核黃素合成途徑可能是更關鍵的反應。

　　2.3 ribA 基因異源引入及過表達

　　根據文獻報道以及 BRENDA 數據庫(https://www.brenda-enzymes.info/index.php)查詢得到枯草自身 RibA 雙功能酶(EC 3.5.4.25 及 EC 4.1.99.12)，但該酶無法將 2 個酶的功能拆分，為了將 GTP 環水解酶 II 單獨過表達，查找到希瓦氏菌來源的 ribA(EC 4.1.99.12)。以 pHP13 為質粒骨架，以 PvegI 及 Pr 為啟動子分別對希瓦氏菌 ribA 基因進行過表達，構建質粒 PSA 和 PRA，電轉化進 S1 菌株，分別得到菌株 SSA 和 SRA，用含空載質粒的 S1-空菌株作為對照，進行補料發酵驗證。

　　圖 4-1 可知，S1-空菌株最大 OD600為 32.2，SSA 及 SRA 菌株最大 OD600有不同程度的下降，分別為 30.2 和 23.3。表明希瓦氏菌 ribA 的表達對菌的生長產生一定的影響，可能與 GTP 在 GTP 環水解酶 II 催化下產生的(DARPP)具有一定的細胞毒性有關。而 Pr 啟動子表達強度強于 PvegI 啟動子，對菌的生長抑制也表現的較為明顯，導致核黃素產量下降。圖 4-2 為發酵結束時核黃素終產量， SSA 菌產量提升至 3.33 g/L，并且發酵結束搖瓶中仍有 4.6 g/L 的葡萄糖剩余。而 SRA 菌產量則明顯下降至 2.69 g/L，耗糖進一步減少，發酵結束搖瓶中葡萄糖剩余 18.4 g/L(圖 4-3)，17 h 時搖瓶內蔗糖已耗盡。SSA 菌株核黃素轉化率為 1 g 糖(0.407 g 蔗糖、0.593 g 葡萄糖)產 0.033 8 g 核黃素，轉化率較 S1 提升 22.9%。

　　2.4 guaC 基因失活及 ribA 基因過表達組合驗證

　　由以上實驗可知，失活 guaC 基因可以提高 GMP 的供給，PvegI 啟動子過表達希瓦氏菌來源的 ribA 基因可以加快 GTP 的利用，從而拉動嘌呤途徑產物的合成使核黃素產量增加，并且認為這 2 種效果是可以疊加的。于是在失活 guaC 基因的 SDC 菌中分別轉入 PSA 質粒以及 PRA 質粒，得到菌株 SDCA 和 SDCR，并將 pHP13-spe 空載質粒轉入 SDC 菌中得到菌株 SDCS，用 SDCS 菌株作為對照，進行補料發酵驗證。

　　圖 5-1 表明，搖瓶補料發酵時 Pr 啟動子表達希瓦氏菌來源 ribA 在 SDC 菌中仍會抑制生長。 SDCA 菌株產量進一步提升，達到 3.43 g/L，相較于 SDCS 菌產量進一步提高 9.2%，相較于初始菌株 S1 產量提升 21.7%(圖 5-2);并且 SDCA 菌耗糖也有所減少，發酵結束時搖瓶中剩余葡萄糖 3.87 g/L。SDCS 菌發酵結束時沒有葡萄糖剩余(圖 5-3)，SDCA 菌株轉化率為 1 g 糖(0.404 g 蔗糖、 0.596 g 葡萄糖)產 0.034 6 g 核黃素，較 S1 菌株提升 25.8%，具有一定的工業生產應用價值。

　　3 結果與討論

　　S1 是一株經過誘變及篩選所得的核黃素高產枯草芽孢桿菌高產菌株，但核黃素合成必須的鳥嘌呤合成途徑并未發生突變。為了使 S1 菌株核黃素合成能力進一步提升，主要對嘌呤合成途徑的相關基因進行失活以及質粒過表達，結果如下：

　　(1)嘌呤合成途徑支路基因失活：運用 CRISPER/dCas9 介導的基因組堿基編輯器技術失活 guaC 基因(編碼 GMP 還原酶)，阻斷了 GMP 到 IMP 的合成，核黃素產量由 2.81 g/L 提升至 3.04 g/L，提升 8.2%，轉化率提升 10.2%。(2)嘌呤合成途徑下游基因過表達：通過質粒將 GMP 下游合成基因 gmk(鳥苷酸激酶)和 ndk (核苷二磷酸激酶)進行過表達，核黃素產量沒有明顯提升，由此確定了這兩步反應不是核黃素合成的瓶頸。(3)希瓦氏菌 ribA 基因引入及過表達：枯草芽孢桿菌中 ribA 基因編碼的蛋白為一種雙功能酶，希瓦氏菌中 ribA(EC 3.5.4.25)和 ribB(EC 4.1.99.12)2 種酶可以拆分單獨存在，故單獨引入了希瓦氏菌 ribA 基因(EC 3.5.4.25)，過表達 GTP 環水解酶 II 部分，將 GTP 更多的轉化為 DARPP，增強嘌呤前體的利用。在搖瓶補料發酵中核黃素產量由 3.09 g/L 提升至 3.33 g/L，并且耗糖有所減少，發酵結束時葡萄糖剩余 4.6 g/L，核黃素轉化率較 S1 提升 22.9% (4)將 guaC 基因失活與希瓦氏菌 ribA 基因過表達進行組合，核黃素產量進一步提升至 3.43 g/L，較初始菌株 S1 產量提升 21.7%，并且耗糖有少量減少，核黃素轉化率提升 25.8%，具有一定的工業生產價值。