紅肉蘋果果實酚類物質含量及抗氧化性測定

　　摘要：以紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛成熟果實為試材，以紅富士為對照，對各品種蘋果果皮、果肉中的總酚、總黃酮、總花青素含量以及DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力(FRAP)、ABTS+•自由基清除能力進行測定，分析酚類物質含量與抗氧化性的相關性。結果表明，紅肉品種紅滿堂、紅色之愛果實中總酚、總黃酮、總花青素含量及其抗氧化性均極顯著高于紅富士對照，且紅滿堂極顯著高于紅色之愛;各品種果皮中總酚、總黃酮、總花青素含量及其抗氧化性均顯著高于果肉;酚類物質含量與抗氧化能力之間存在顯著相關性。紅滿堂果實具有高的酚類物質含量與抗氧化能力，可以作為高類黃酮加工型品種進行開發利用。

　　本文源自山西農業科學,2020,48(11):1763-1766+1776.《山西農業科學》(月刊)創刊于1961年，由山西省農業科學院主辦。主要刊載生物技術、遺傳育種、耕作栽培、生理生化、資源與環境、植物保護、貯藏加工、畜牧獸醫等學科的研究報告、學術論文及綜合述評等。

　　蘋果(MalusdomesticaMill.)是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)植物，屬于落葉喬木，在我國已經有2000多年的栽培歷史[1]。蘋果酸甜清香，不僅含有蛋白質、糖類、有機酸、維生素和微量元素等，還含有多酚、類黃酮等功能性物質。其中，酚酸、黃酮類物質及花青素等是蘋果中主要的酚類物質[2]。對藍靛果[3]、獼猴桃[4]、杏[5]、藍莓[6]的研究表明，酚類物質具有強的抗氧化功能，有益人類健康[7]。

　　“醫食同源”是目前果業的發展方向，“吃營養，吃健康”已經成為人們的共識[8]。紅肉蘋果(MaluspumilaMill.)是新疆野蘋果的一個變種，原產我國新疆伊犁地區以及中亞的哈薩克斯坦等地[9]，具有酚類物質含量高的特點。因此，有效利用新疆野蘋果等種質資源，開展遠緣雜交育種，進一步培育高類黃酮(紅肉與紅皮)蘋果，對于推動我國蘋果產業的優質高效發展及“健康中國”均具有重要意義[10]。

　　本研究以紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛(RedLove)成熟果實為試材，以紅富士為對照，測定3個品種的總酚、總黃酮、總花青素含量以及抗氧化性，并對酚類物質含量與抗氧化性進行相關性分析，旨在篩選出高類黃酮、高抗氧化品種。

　　1、材料和方法

　　1.1 試驗材料

　　試驗所用蘋果品種(圖1)為紅肉品種紅滿堂、紅色之愛(RedLove)，以白肉品種紅富士為對照，均采摘成熟期果實。

　　1.2 試驗方法

　　每個蘋果品種選取5株長勢基本一致、生長發育良好的樹，在樹冠外圍隨機采取果實20個。單株小區，5次重復。果實通過清洗、擦干，取薄厚一致的果皮(約1.0mm)及去核果肉，用液氮速凍后冷凍研磨儀粉碎成細粉，稱質量分裝，存放于-80℃冰箱保存備用。

　　1.2.1 酚類物質的提取

　　參照汪曉謙[11]的方法提取。以70%甲醇內含2%甲酸的混合溶液為提取液。提取時，稱取果皮或果肉0.1g，在0℃下加1mL提取液研磨之后再加1mL提取液沖洗研缽，將2次加入的提取液并入離心管。將離心管于25℃、1000r/min條件下振蕩30min，之后在10000g下離心10min，取上清液待用。

　　1.2.2 總酚含量的測定

　　總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[12]。在離心管中依次加入20μL果實提取液、1.58mL蒸餾水、0.1mLFolin-Ciocalteu試劑(1∶1稀釋)，搖勻，充分反應1min后加入飽和Na2CO3溶液1.5mL，避光反應2h。以提取溶劑為對照，用分光光度計在765nm波長下測定吸光度，結果以沒食子酸當量(GAE)表示，單位為mg/g。

　　1.2.3 總黃酮含量的測定

　　總黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[13]。在離心管中依次加入0.5mL果實提取液、0.15mL5%NaNO2溶液，靜置6min后加入0.15mL10%Al(NO3)3溶液，靜置6min后加入2mL4%NaOH溶液，最后加入2.2mL蒸餾水，振蕩混勻靜置3min后于508nm下測定吸光度，結果以蘆丁當量(RE)表示，單位為mg/g。

　　1.2.4 總花青素含量的測定

　　總花青素含量的測定采用pH示差法。取果實提取液2mL至10mL試管中，分別用pH=1.0(0.2mol/LKCl∶0.2mol/LHCl=25∶67,V/V)、pH=4.5(醋酸-醋酸鈉緩沖液：取18g醋酸鈉，加冰醋酸9.8mL，再加水稀釋至1000mL)的緩沖液定容，反應30min，用紫外分光光度計在510、700nm處測定吸光度，以矢車菊-3-葡萄糖苷表示，利用公式進行花青素含量測定，單位為mg/kg。

　　式中，A為待測液花青素總吸光度;ΔApH1為pH值為1條件下的吸光度差值;ΔApH4.5為pH值為4.5條件下的吸光度差值;A510為待測液花青素在510nm處的吸光度;A700為待測液花青素在700nm處的吸光度;c為待測液花青素質量分數;V為提取液總體積(mL);DF為稀釋倍數;M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質量(449.2g/mol);ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(29600L/(mol·cm));m為樣品質量(g);L為光程(1cm)。

　　1.2.5 DPPH法測定抗氧化性

　　DPPH法測定抗氧化活性參照ZHANG等[14]的方法。用無水乙醇溶解DPPH，使溶液的物質的量濃度達到0.1mmol/L，配制完成后置于包裹錫箔紙的燒瓶中，4℃暗保存。測定時取0.1mL待測樣品，加入4mL0.1mmol/LDPPH溶液，充分振蕩30s，暗反應30min之后，于517nm處測定吸光度。

　　繪制抗壞血酸的自由基清除率相對于其濃度的標準曲線。DPPH抗氧化活性單位為mg/100g。

　　1.2.6 FRAP法測定抗氧化性

　　FRAP法測定抗氧化活性參照ZHANG等[14]的方法。FRAP儲備液由300mmol/L乙酸鈉緩沖液(3.1gC2H3NaO2·3H2O+16mLC2H4O2,pH=3.6)、10mmol/LTPTZ溶液(溶于40mmol/LHCl)以及20mmol/LFeCl3·6H2O這3種溶液按照10∶1∶1的體積比混合而成，現用現配。測定時，取20μL果實提取液加入1mL水與2mLFRAP儲備液，充分混合，于37℃反應10min后，在593nm處測定吸光度。

　　繪制以水溶性維生素E(Trolox)為標樣的標準曲線。樣品的FRAP抗氧化活性單位為mg/100g。

　　1.2.7 ABTS法測定抗氧化性

　　ABTS法測定抗氧化活性參照AMIR等[15]的方法，略有改動。ABTS+·儲備液由5mL7mmol/LABTS溶液和5mL2.45mmol/LK2S2O8溶液混合之后，于室溫暗反應12h后制成。測定時用乙醇稀釋ABTS+·儲備液，于734nm處測得0.70±0.02的吸光度。之后將50μL果實提取液與4mL乙醇稀釋后的ABTS+·儲備液混合，避光反應6min后于734nm處測定吸光度。樣品的ABTS抗氧化性單位為mg/100g。

　　1.3 數據處理與分析

　　試驗結果以平均值±標準差表示。使用Origin2018制圖，運用SAS8.1軟件對所得數據進行顯著性差異分析，運用SPSS21軟件中Pearson函數對總酚含量、總黃酮含量、總花青素含量與以DPPH法、FRAP法、ABTS法測定的抗氧化性之間的相關性進行計算。

　　2、結果與分析

　　2.1 紅肉蘋果果實酚類物質含量分析

　　由圖2-A可知，紅滿堂果皮總酚含量最高，為9899.99mg/kg，極顯著高于紅色之愛(8474.12mg/kg)和紅富士(7563.81mg/kg);紅滿堂果肉總酚含量最高，為4124.74mg/kg，極顯著高于紅色之愛(3614.01mg/kg)和紅富士(2627.64mg/kg)。

　　從圖2-B可以看出，紅滿堂果皮總黃酮含量最高，為39459.77mg/kg，極顯著高于紅色之愛(25546.51mg/kg)和紅富士(21022.64mg/kg);紅滿堂果肉總黃酮含量最高，為15455.34mg/kg，極顯著高于紅色之愛(11486.47mg/kg)和紅富士(7697.58mg/kg)。

　　從圖2-C可以看出，紅滿堂果皮總花青素含量最高，為499.68mg/kg，極顯著高于紅色之愛(271.19mg/kg)和紅富士(201.67mg/kg);紅滿堂果肉總花青素含量最高，為135.37mg/kg，極顯著高于紅色之愛(58.88mg/kg)和紅富士(35.98mg/kg)。

　　3個品種總酚、總黃酮、總花青素含量均表現為果皮顯著高于果肉。

　　2.2 紅肉蘋果果實抗氧化性分析

　　由圖3-A可知，紅滿堂果皮DPPH自由基清除能力最強(510.47mg/100g)，極顯著高于紅色之愛(318.51mg/100g)和紅富士(170.59mg/100g);紅滿堂果肉DPPH自由基清除能力最強(439.04mg/100g)，極顯著高于紅色之愛(248.37mg/100g)和紅富士(71.94mg/100g)。

　　由圖3-B可知，紅滿堂果皮FRAP抗氧化能力最強，為381.39mg/100g，極顯著高于紅色之愛(303.60mg/100g)和紅富士(108.80mg/100g);紅滿堂果肉FRAP抗氧化能力最強，為238.51mg/100g，極顯著高于紅色之愛(89.55mg/100g)和紅富士(52.65mg/100g)。

　　由圖3-C可知，紅滿堂果皮ABTS+·自由基清除能力最強，為581.61mg/100g，極顯著高于紅色之愛(515.33mg/100g)和紅富士(214.12mg/100g);紅滿堂果肉ABTS+·自由基清除能力最強，為365.29mg/100g，極顯著高于紅色之愛(244.51mg/100g)和紅富士(143.82mg/100g)。

　　3個品種DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力、ABTS+·自由基清除能力都表現為果皮顯著高于果肉。

　　2.3 果實酚類物質含量與抗氧化性的相關性分析

　　對果實酚類物質(總酚、總黃酮、總花青素)含量與抗氧化性(DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力)進行相關性分析，結果如圖4所示，果皮中總酚、總黃酮和總花青素含量都與DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關;果皮中總酚與FRAP抗氧化能力呈顯著正相關，總黃酮、總花青素與FRAP抗氧化能力不存在顯著相關性;果皮中總酚含量與ABTS+·自由基清除能力呈極顯著正相關，總黃酮、總花青素與ABTS+·自由基清除能力呈顯著正相關。

　　果肉中總酚、總黃酮、總花青素含量與3個抗氧化指標均呈極顯著正相關。

　　3、結論與討論

　　HU等[16]對蘋果果實酚類物質研究表明，蘋果屬植物在不同組織中，其含量具有顯著差異。HOLDERBAUM等[7]對蘋果酚類物質分布的研究發現，蘋果果皮中總酚含量大于果肉中含量。本研究結果表明，紅肉蘋果紅滿堂果實中酚類物質含量極顯著高于紅色之愛和紅富士，且3個品種果皮中酚類物質含量均顯著高于果肉中含量，這一結果與前人研究結論一致。

　　本試驗對蘋果果實DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化(鐵離子還原)能力以及ABTS+·自由基清除能力進行分析，結果表明，紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛果實的DPPH自由基、ABTS+·自由基清除能力、FRAP抗氧化能力極顯著高于紅富士，且紅滿堂極顯著高于紅色之愛。前人研究的結果表明，蘋果抗氧化性與蘋果酚類物質組成及含量密切相關，酚類物質越豐富，蘋果的抗氧化性越強[17]。本研究通過對果實酚類物質(總酚、總黃酮、總花青素)含量與抗氧化性(DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力)進行相關性分析的結果也支持了此結果。紅滿堂果實高的酚類物質含量及其高的抗氧化性，說明紅滿堂可作為加工型高酚類品種進行開發利用。紅滿堂是以舞美、山定子為親本雜交選育出的新型紅肉品種，其果實自幼果期直至成熟期均為紫紅色，果汁呈血紅色[18]，果肉不易褐變，可做天然藥妝品。本研究進一步為紅滿堂的開發利用提供了理論支撐。

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