FaRALF1基因調(diào)控‘紅顏’草莓果實(shí)成熟的功能分析

　　摘要多肽信號廣泛存在于高等植物體內(nèi)，并對植物的生長發(fā)育和果實(shí)成熟起重要的調(diào)控作用，為探究多肽信號調(diào)控植物果實(shí)成熟機(jī)制，本研究以八倍體‘紅顏’草莓為試驗(yàn)材料，通過生物信息學(xué)技術(shù)在草莓全基因組中鑒定出一類植物多肽信號家族RALF(Rapidalkalinizationfactors)，并根據(jù)染色體上的定位命名將其為FaRALF1-FaRALF9，通過分析FaRALFs基因家族成員在草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異，以及其對脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、蔗糖處理(Suc)的響應(yīng)特征分析，初步推測家族成員FaRALF1可能參與調(diào)控草莓果實(shí)成熟。通過構(gòu)建FaRALF1基因的超表達(dá)FaRALF1-OE(OverExpression)和RNA干擾FaRALF1-RNAi(RNAinterference)載體瞬時(shí)侵染大綠時(shí)期的草莓果實(shí)，通過體視熒光顯微鏡觀察侵染5d后草莓果實(shí)的熒光標(biāo)簽和成熟表型，并通過qRT-PCR(Quantitativereal-timePCR)分析基因表達(dá)量，其中FaRALF1-OE促進(jìn)草莓果實(shí)成熟;相反，F(xiàn)aRALF1-RNAi抑制果實(shí)成熟。本研究初步表明植物多肽信號家族成員FaRALF1基因參與調(diào)控‘紅顏’草莓果實(shí)成熟，且表達(dá)量與果實(shí)成熟程度呈正相關(guān)，為研究植物多肽信號調(diào)控果實(shí)成熟機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

　　本文源自分子植物育種 發(fā)表時(shí)間：2021-03-18《分子植物育種》(雙月刊)創(chuàng)刊于2003年，由海南省生物工程協(xié)會主辦。是一份為轉(zhuǎn)基因育種、分子標(biāo)記輔助育種及常規(guī)育種服務(wù)的國際化科學(xué)期刊，內(nèi)容涉及了水稻、小麥、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯類、果樹、蔬菜、花卉、茶葉、林草等多方面，主要是刊登分子遺傳育種理論、分子育種方法、分子育種研究動態(tài)以及優(yōu)良種質(zhì)培育的科學(xué)論文報(bào)道。主要欄目：專題評述、研究論文、研究報(bào)告、專題介紹、論文簡報(bào)、新基因、新種質(zhì)、新品種、新思路、新技術(shù)、新方法、術(shù)論壇與信息。

　　關(guān)鍵詞草莓;快速堿化因子;果實(shí)成熟

　　植物自身代謝產(chǎn)生了多種植物激素和多肽信號，這些信號分子形成的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控植物的各種生理活動(Pearceetal.,2001;VanstraelenandBenková,2012;HirakawaandSawa,2019)。目前已研究較深入的植物激素主要包括生長素(Auxins)、細(xì)胞分裂素(Cytokinins)、赤霉素(gibberellin,GA)、脫落酸(abscisicacid,ABA)、乙烯(Ethylene)等，但多肽信號分子的發(fā)現(xiàn)至今僅有30年，其對于植物生長發(fā)育和果實(shí)成熟的研究較少且很多相關(guān)的分子機(jī)制尚不清晰。多肽信號分子主要包括Systemin、ENOD40(EARLYNODULIN40)、PSK(Phytosulfokine)、CLV3(CLAVATA3)、SP11/SCR(S-locusprotein11/S-locuscysteine-richprotein)和RALF等六類(VanstraelenandBenková,2012)。其中，RALF是植物多肽超級大家族中的一個(gè)亞家族，在植物中廣泛存在，已經(jīng)在51種植物中得到鑒定(CampbellandTurner,2017)，其廣泛分布在植物的營養(yǎng)和生殖器官，包括根、莖、葉、種子和花粉管等參與多種不同的生理活動調(diào)控(MurphyandDeSmet,2014)，主要包括細(xì)胞膨大(Harutaetal.,2014)、側(cè)根發(fā)育(MurphyandDeSmet,2014)、根毛生長(Wuetal.,2007)和花粉管伸長與受精(Geetal.,2017)等。RALF家族包含了大量成員(Sharmaetal.,2016)，但只有極少數(shù)RALF成員被鑒定出來，而對RALF信號系統(tǒng)核心元件的鑒定和功能研究更是少之又少。目前，只有擬南芥AtRLK1L家族的3個(gè)成員FER、BUPS1和BUPS2作為RALF信號分子的受體被鑒定和證實(shí)(Harutaetal.,2014;Geetal.,2017;Du,2016)。根據(jù)已有研究，RALF信號在調(diào)控植物生長發(fā)育的功能研究中取得了一定進(jìn)展，但其調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)的功能及機(jī)理，特別是在信號系統(tǒng)中起調(diào)控作用的關(guān)鍵蛋白及其作用的分子機(jī)制仍不清楚。

　　草莓作為典型的非呼吸躍變型果實(shí)，已經(jīng)成為果樹分子生物學(xué)研究的模式材料(Jiaetal.,2011)。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，從八倍體‘紅顏’草莓(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)鑒定出植物多肽信號家族RALF(Rapidalkalinizationfactors)，初步探究植物多肽RALF信號是否參與調(diào)控草莓果實(shí)成熟，為深入挖掘調(diào)控草莓果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成的基因資源奠定基礎(chǔ)，對于通過基因工程創(chuàng)制草莓新品種具有重要意義。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1‘紅顏’草莓FaRALF家族鑒定

　　通過生物信息學(xué)技術(shù)，在草莓全基因組鑒定出9個(gè)RALF家族成員(表1)。根據(jù)在染色體的物理位置分別命名為FaRALF1-FaRALF9(圖1)，第1、6、7條染色體分別有1個(gè)家族成員，第2、3、4條染色體分別有2個(gè)家族成員，而第5條染色體沒有發(fā)現(xiàn)家族成員。從FaRALFs蛋白基本信息中可知，F(xiàn)aRALF家族成員開放閱讀框長度在102~134之間，其中FaRALF9氨基酸數(shù)最多，為134個(gè);分子量在11287(FaRALF3)~15460kD(FaRALF9)之間;等電點(diǎn)在6.7~9.82之間，其中，F(xiàn)aRALF4為弱酸性蛋白，其余成員均為堿性蛋白;親水系數(shù)的范圍從-0.673到-0.008，其中親水性最強(qiáng)的為FaRALF6;不穩(wěn)定指數(shù)從29.93-54.70，其中最不穩(wěn)定的為家族成員為FaRALF2，而最穩(wěn)定的為FaRALF7。FaRALF家族成員的理化參數(shù)的獲取為深入研究家族成員蛋白表達(dá)、純化和功能提供依據(jù)。

　　1.2草莓FaRALF家族對激素的響應(yīng)特征

　　為探究FaRALF家族對果實(shí)成熟的調(diào)控功能，本研究選擇已被證實(shí)為對草莓果實(shí)成熟具有調(diào)控功能的4種激素信號物質(zhì)(ABA,IAA,BR和Suc)來處理大綠時(shí)期的草莓果實(shí)。結(jié)果顯示(圖2)，RALF家族成員對激素處理響應(yīng)顯著。IAA、BR和Suc處理下，RALF家族成員基因表達(dá)量明顯增加，尤其是對BR響應(yīng)比較劇烈，其中，F(xiàn)aRALF8基因表達(dá)量是對照的13.21倍。但是，F(xiàn)aRALF2和FaRALF3在ABA處理下，其表達(dá)量均出現(xiàn)降低。因此，該結(jié)果也暗示著FaRALF家族可能參與調(diào)控草莓果實(shí)成熟。

　　1.3草莓FaRALF家族在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征為研究FaRALF家族在草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征，將草莓果實(shí)發(fā)育分成5個(gè)時(shí)期，即，小綠期(smallgreen,SG)、中綠期(mediumgreen,MG)大綠期(biggreen,BG)、轉(zhuǎn)色期(turning,TN)、全紅期(fullyred,FR)。結(jié)果顯示(圖3)，F(xiàn)aRALF家族基因表達(dá)量在果實(shí)成熟過程中表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。FaRALF1表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育前期緩慢增加，轉(zhuǎn)色期后迅速增加，F(xiàn)aRALF4、FaRALF6、FaRALF7和FaRALF8表達(dá)量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，而FaRALF2、FaRALF3、FaRALF5和FaRALF9則隨著果實(shí)發(fā)育而降低，其中，F(xiàn)aRALF5在中綠果期后幾乎不表達(dá)，F(xiàn)aRALF9的表達(dá)量降低最劇烈，小綠果期的表達(dá)量是全紅期的512.1倍。這些結(jié)果可能暗示FaRALF家族成員在草莓果實(shí)成熟進(jìn)程中發(fā)揮著不同的作用。

　　1.4FaRALF1調(diào)控草莓果實(shí)成熟的功能分析

　　為研究FaRALF家族調(diào)控草莓果實(shí)成熟的功能，本研究以篩選出與草莓成熟相關(guān)度最高的家族成員FaRALF1為研究對象，通過構(gòu)建攜帶FaRALF1基因的干擾、過表達(dá)載體瞬時(shí)侵染草莓果實(shí)，分析果實(shí)表型及對熒光標(biāo)簽進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示(圖4)，5d后在體式熒光顯微鏡下均能觀察到DsRed紅色熒光，說明FaRALF1-OE和RNAi載體均成功轉(zhuǎn)化到果實(shí)內(nèi)?？蛰d處理的對照果實(shí)部分變紅，F(xiàn)aRALF1-RNAi干擾處理果實(shí)只有少量變紅，而FaRALF1-OE過表達(dá)處理果實(shí)則全部變紅，表明FaRALF1-RNAi抑制草莓果實(shí)成熟，而FaRALF1-OE則促進(jìn)草莓果實(shí)成熟。熒光定量PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步表明(圖5)，F(xiàn)aRALF1-OE過表達(dá)處理基因表達(dá)量是對照的4.11倍，而FaRALF1-RNAi干擾處理基因表達(dá)量是對照的0.15倍。以上結(jié)果說明，F(xiàn)aRALF1正調(diào)控草莓果實(shí)成熟。

　　2討論

　　本研究在八倍體草莓基因組鑒定出9個(gè)RALF家族成員，并根據(jù)染色體物理定位進(jìn)行命名。鑒定家族成員在草莓果實(shí)不同時(shí)期表達(dá)量以及對于生物脅迫的響應(yīng)程度。對FaRALF1進(jìn)行過表達(dá)、RNA干擾瞬時(shí)轉(zhuǎn)化果實(shí)處理，并從表型、基因?qū)用孢M(jìn)行驗(yàn)證，初步認(rèn)為FaRALF1參與正調(diào)控草莓果實(shí)發(fā)育成熟。

　　眾所周知，不論是呼吸躍變型果實(shí)還是非呼吸躍變型果實(shí)，植物激素具有微量高效的特點(diǎn)，并在果實(shí)成熟過程中具有重要的調(diào)控作用。特別是ABA(Jiaetal.,2013;Liaoetal.,2018)、IAA(Fengetal.,2019)等已被證實(shí)參與果實(shí)成熟的調(diào)控過程。本研究發(fā)現(xiàn)RALF家族對ABA的響應(yīng)與對照果實(shí)具有顯著性差異，大部分成員在ABA處理時(shí)基因表達(dá)量升高，只有FaRALF2/3在ABA處理下，表達(dá)量降低。因此，該結(jié)果也預(yù)示RALF家族可能參與調(diào)控草莓果實(shí)成熟。且擬南芥中RALF基因在不同器官中存在著不同表達(dá)譜的研究結(jié)果表明，隨著不同的發(fā)育階段以及植物受到的生物、非生物脅迫，RALF具有廣泛的表達(dá)特征(MacintoshandGreen,2001)。本研究對于生物脅迫的處理結(jié)果符合前人研究結(jié)果(圖2)：RALF家族對激素處理均表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)，在IAA、BR和Suc處理下相關(guān)基因的表達(dá)量明顯增加，且對BR響應(yīng)尤為劇烈，其中，F(xiàn)aRALF8基因表達(dá)量是對照果實(shí)中的13.21倍。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中也發(fā)現(xiàn)BR參與調(diào)控草莓果實(shí)早期成熟進(jìn)程(Chaietal.,2013)。這表示RALF家族可能通過BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑參與調(diào)控果實(shí)成熟。

　　此前有研究表明RALF家族成員可能參與草莓不同組織和器官的發(fā)育，不同的成員可能對不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)產(chǎn)生影響，特別是對于FvRALF1，F(xiàn)vRALF2，F(xiàn)vRALF5，F(xiàn)vRALF10和FvRALF12可能對瘦果期和花托期果實(shí)發(fā)育有影響(Zhangetal.,2020)。如圖所示，RALF家族成員在草莓果實(shí)中均有表達(dá)，并且隨著果實(shí)成熟進(jìn)程表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律(圖3)。RALF4/6/7/8表達(dá)量隨著果實(shí)成熟進(jìn)程呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，RALF2/3/5/9隨著果實(shí)成熟進(jìn)程而降低，而FaRALF1表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育前期緩慢增加，轉(zhuǎn)色期后迅速增加。這些結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致，也表明FaRALF家族成員在草莓果實(shí)成熟進(jìn)程中發(fā)揮著不同的作用。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步驗(yàn)證FaRALF1參與草莓果實(shí)發(fā)育成熟的功能，本研究利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)處理八倍體‘紅顏’草莓果實(shí)。結(jié)果均能觀察到DsRed紅色熒光(圖5)，說明FaRALF1-OE和FaRALF1-RNAi載體均在成功轉(zhuǎn)入果實(shí)細(xì)胞內(nèi)并在果實(shí)體內(nèi)成功表達(dá)。由瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因成功后的果實(shí)表型可以發(fā)現(xiàn)FaRALF1-OE促進(jìn)草莓果實(shí)成熟，而FaRALF1-RNAi則抑制草莓果實(shí)成熟。以上結(jié)果表明，F(xiàn)aRALF1正調(diào)控草莓果實(shí)成熟。

　　模式植物和主要農(nóng)作物中已經(jīng)有研究表明，植物的生長發(fā)育過程是由植物分泌的多肽信號分子和非蛋白質(zhì)類的信號分子共同形成的信號網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控(HirakawaandSawa,2019)。本研究結(jié)果表明(圖2)：RALF家族成員對于ABA、IAA、蔗糖等非蛋白質(zhì)類信號響應(yīng)敏感。盡管目前未在草莓果實(shí)的發(fā)育成熟中揭示出RALF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但有報(bào)道指出RALFs還參與調(diào)控植物響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答，RALF通過其受體FERONIA發(fā)揮生物學(xué)功能，在對于受體FER的磷酸化程度上表現(xiàn)與ABA一致(Guptaetal.,2010;Atkinsonetal.,2013)。草莓中也鑒定出一個(gè)重要的細(xì)胞質(zhì)蛋白激酶FaRIPK1，通過ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑參與調(diào)控草莓果實(shí)成熟(Houetal.,2018)。同時(shí)擬南芥中的研究表明，某些RALF成員可以和FER結(jié)合，而FER和細(xì)胞質(zhì)蛋白激酶RIPK結(jié)合形成激酶復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)RALF信號抑制根系生長發(fā)育(Du,2016)。盡管RALF信號調(diào)控?cái)M南芥根系生長發(fā)育和調(diào)控草莓果實(shí)成熟的作用不同，但是RALF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子作用機(jī)制應(yīng)該是相似的。

　　本研究在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證了FaRALF1的功能，但并未對所鑒定的9個(gè)家族成員均進(jìn)行功能載體構(gòu)建以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn);僅對果實(shí)進(jìn)行了不同時(shí)期基因表達(dá)量測定，相比而言，不同部位的時(shí)空表達(dá)測定更具有代表性;對于本研究更深入的結(jié)果分析及后續(xù)的研究仍存在一定局限性。但結(jié)合本研究與前人研究結(jié)果，該研究對于揭示多肽信號參與草莓果實(shí)發(fā)育成熟以及深入挖掘草莓成熟發(fā)育相關(guān)基因具有重要意義;針對目前人工栽培種草莓異花授粉以及易感染真菌病害的特點(diǎn)，多肽信號介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制對于提高栽培種草莓品質(zhì)和創(chuàng)制新品種草莓提供了重要參考價(jià)值。

　　3材料與方法

　　3.1植物材料

　　試驗(yàn)材料為北京農(nóng)學(xué)院組織培養(yǎng)中心種植八倍體草莓‘紅顏’(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)，溫度為20℃~26℃、相對濕度為70%~90%、光照14h、黑暗10h。

　　主要試劑包括RNA提取試劑盒(OMEGA)、BP、LR反應(yīng)試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)等，均購于北京華佰泰生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、T1Simple、Trans1-T1PhageResistant感受態(tài)細(xì)胞購買與北京全式金生物技術(shù)有限公司;農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購于北京華越洋生物技術(shù)有限公司。

　　3.2目的基因的克隆

　　將‘紅顏’草莓果實(shí)于液氮中保存，按照OMEGA試劑盒要求提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，使用NEB公司Q5高保真酶進(jìn)行PCR克隆目的基因，所用引物序列已列出(表2)。

　　3.3不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)量測定

　　草莓果實(shí)成熟期分五個(gè)時(shí)期，即：小綠期(smallgreen,SG)中綠期(mediumgreen,MG)大綠期(biggreen,BG)、轉(zhuǎn)色期(turning,TN)和全紅期(fullyred,FR)。基因表達(dá)量分析方法參照文獻(xiàn)(柴葉茂等,2011)。

　　3.4載體構(gòu)建

　　通過Gateway體系構(gòu)建FaRALF1基因的過表達(dá)(pH7FWG2-RR-293-DsRed)及沉默載體(pK7GWIWG2(II)RR-277-DsRed)，功能載體均攜帶獨(dú)立表達(dá)的DsRed熒光標(biāo)簽;引物序列見表2。具體方法參照文獻(xiàn)(谷曉嬌和沈元月,2020)。

　　3.5瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

　　將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，挑取單克隆菌株活化。將瞬時(shí)侵染處理后的草莓果實(shí)置于智能人工氣候箱中，溫度為25℃，相對濕度為80%，黑暗處理5d。具體方法參照文獻(xiàn)(王樹芳,2018)。

　　3.6激素處理

　　激素處理包括：25℃條件下：100μmol/L脫落酸(ABA)處理果實(shí)6h，500μmol/L生長素(IAA)處理果實(shí)6h，100mmol/L蔗糖(Suc)處理果實(shí)6h，100μmol/L油菜素內(nèi)酯(BR)處理果實(shí)8h，對照處理(LB培養(yǎng)液,6h)保持在25℃和100%相對濕度。選擇大綠期的果實(shí)后處理。具體方法參照文獻(xiàn)(盧文靜,2018)

　　3.7FaRALF家族生物信息學(xué)分析

　　草莓RALF家族在三個(gè)公共數(shù)據(jù)庫中鑒定：國家生物技術(shù)信息中心，草莓基因組瀏覽器和PLAZA。草莓RALF家族蛋白理化參數(shù)分析通過ExPasy網(wǎng)站提供的工具計(jì)算推定蛋白基本信息。具體方法參照。