真菌群落多樣性及組成結構對不同耕作模式的響應機制

　　摘 要: 為揭示東北黑土玉米田土壤真菌群落對旋耕、深松、深翻和秸稈還田四種耕作方式的響應機制，在長期定位種植區采集旋耕(RT)、深松(SU)、深松秸稈覆蓋(SS)和深翻秸稈還田(DP)土壤樣品，依托 Illumina MiSeq 高通量測序平臺，研究了土壤真菌群落結構及其與土壤環境因子的相關關系。結果表明: 4 個處理共獲得 1724 個可操作分類單元 ( OTUs) 。子囊菌門和擔子菌門為土壤中優勢菌門，其相對豐度總和為 78.64%~85.05%。SU、 SS 處理下子囊菌門糞殼菌綱(Sordariomycetes)的相對豐度最高，DP 處理下擔子菌門銀耳綱 ( Tremellomycetes)的相對豐度最高。土壤中腐生菌群、與玉米共生的內生菌和外生菌根菌在 SS 中相對較高。4 個處理真菌群落多樣性指數依次為 SS>RT>SU>DP。多元分析結果表明，土壤纖維素酶活性、速效鉀、有機質、速效磷、土壤堿解氮與土壤真菌群落結構顯著相關。Ascomycota 與速效鉀極顯著相關，Basidiomycota 與 pH 極顯著正相關，與土壤纖維素酶活性極顯著負相關。在黑龍江西部玉米種植地區以深松秸稈覆蓋的耕作模式有利于提高土壤真菌群落多樣性。

　　本文源自宋秀麗; 盤雨薇; 孫士明; 王俊河; 靳曉燕; 龐愛國; 于曉波; 金新月; 郝天樂; 宋翔雨; 楊德光， 玉米科學 發表時間：2021-04-09 17:31 期刊《玉米科學》(雙月刊)創刊于1992年，是由吉林省農業科學院主辦的我國惟一的玉米專業學術期刊，在國內外玉米界具有較大影響。

　　關鍵詞: 玉米;真菌;群落結構;多樣性;高通量測序

　　土壤微生物是土壤生態系統的核心，土壤微生物群落結構決定土壤功能[1,2]。氣候條件、土壤類型、土壤理化性質、植被類型和人類干擾活動與土壤微生物群落結構和功能相關[3]。與細菌相比，目前有關土壤真菌的研究主要集中在不同地域、不同土壤理化性質條件下真菌群落分布特征[4]，真菌群落結構與功能對土地利用方式、施肥方式、植被類型的響應[5]，以及真菌群落結構與土壤有機碳的相關關系等[6,7]。但我國幅員遼闊，地域環境條件及相關影響因素差異顯著，因此對土壤真菌群落的研究總體相對薄弱[8]。

　　在農業生產過程中，優化集成耕作模式是現代農業的重要措施之一[9]。獲得作物高產穩產，一般采用施用化肥、有機肥、秸稈還田與耕作方式進行優化集成 [10,11]。選擇合理耕作模式，維持、改善土壤微生物群落結構和多樣性，對提高農田土壤生產力，增強土壤緩沖、抗逆能力具有重要意義[12,]。黑龍江西部地區土壤沙化嚴重、保水保肥能力相對較差，學者們嘗試開展免耕、翻耕、旋耕、有機肥、秸稈還田等方式構建耕層，改善土壤肥力，但是關于不同耕作方式下真菌群落結構和功能多性的研究鮮有報道，研究不同耕作方式土壤微生物群落結構特征可以為選擇和評價種植模式提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究區自然概況

　　實驗地位于黑龍江省齊齊哈爾富拉爾基區(47.2623° N, 123.6886° E)，中溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫 3.2℃，全年有效積溫 2700℃左右，降水集中 7 —8 月，年降雨量 415mm。試驗前土壤 pH 為 8.35，有機質含量 13.33 g·kg-1，全氮含量 0.78 g·kg-1，堿解氮含量 58.04 mg·kg-1，全磷含量 0.82 g·kg-1，速效磷含量 47.77mg·kg-1，速效鉀含量 311.5 mg·kg-1。

　　1.2 實驗設計

　　試驗開始于 2015 年 10 月，為長期定位試驗，地勢平坦均勻，設有免耕、深松、深松秸稈還田和深翻秸稈還田四個處理，采用隨機區組設計，3 重復，小區面積 27 m×50m。旋耕處理(RT)：秋季玉米凈茬處理，旋耕深度 12~16cm，春季免耕播種;深松處理(SU)：秋季玉米凈茬處理，深松 30~35cm 以上，春季免耕播種;深松秸稈還田(SS)：秋季玉米秸稈全量還田。玉米機械收獲秸稈粉碎聯合作業，留茬高度 5~10cm，秸稈切碎長度要小于 10cm，拋撒均勻，深松 30~35cm。春季免耕播種;深翻秸稈還田(DP)：秋季玉米秸稈全量還田。采用玉米機械收獲秸稈粉碎聯合作業，玉米留茬高度 5～10cm，秸稈切碎長度小于 10cm，拋撒均勻，深翻犁深翻 30～35cm，扣垡嚴密，耙深 10～14cm。春季免耕播種玉米嫩單 19，種植期內統一管理。2019 年 10 月作物收獲后，在各小區利用“S”形 5 點取樣法采集 0～30 cm 土壤樣品，冰盒保存帶回實驗室，所有土壤樣品過 2 mm 網篩，除去雜物，一份儲存于-80℃ 低溫冰箱用于土壤真菌多樣性的測定，一份自然風干進行土壤理化指標的測定。

　　1.3 測定項目與方法

　　1.3.1 土壤真菌 DNA 提取和 PCR 擴增

　　土壤真菌總 DNA 提取采用 Fast DNA SPIN kit 試劑盒(MP Biomedicals，美國) ，嚴格按照說明書中的操作步驟進行 DNA 提取。采用真菌特異引物 (ITS1F/2043R) 對真菌 18S rRNA 基因的 ITS1F-ITS2 區段進行擴增，正向引物為 ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') ， 反 向 引 物 為 2043 R (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3') 。PCR 反應體系見參考文獻[13]。采用 Illumina Mi Seq 測序平臺對 PCR 擴增產物進行雙端測序，測序委托上海天昊生物科技有限公司完成。

　　1.3.2 高通量測序數據分析

　　采用 Illumina Miseq 平臺對真菌 DNA 進行雙端測序。根據 Barcode 序列和 PCR 擴增引物序列從下機數據中拆分和拼接出各樣品數據，采用滑動窗口法對 FASTQ 格式的雙端序列原始數據逐一質量篩查。運用 QIIME 軟件( v1.8.0) 識別疑問序列，通過調 USEARCH (v5.2.236)檢查并剔除嵌合體序列; 隨后調用 UCLUST 序列比對工具，對前述獲得序列按 97%的序列相似度進行歸并和 OTU 劃分，并選取每個 OTU 中豐度最高的序列作為該 OTU 的代表序列。根據每個 OTU 在每個樣本中所包含的序列數，構建 OTU 豐度矩陣; 通過將 OTU 代表序列與對應 UNITE 數據庫的模板序列比對，獲取每個 OTU 所對應的真菌分類學信息，得到 OTU 代表序列的系統發育地位[14]。通過 FUNGulid 對真菌微生物群落進行功能注釋。使用 QIIME 軟件，對 Weighted 的 UniFrac 距離矩陣進行非加權配對平均法( UPGMA)分析，采用 Mothur 軟件計算 Simpson、Shannon、Chao1 和 ACE 指數[15]。

　　1.3.3 土壤化學性質測定

　　土壤 pH 值 按水土比 2.5:1，采用 pH 計測定;土壤有機質(SOM)采用重鉻酸鉀容量法;堿解氮采用擴散法;速效磷用 0.5 mol/L NaHCO3 浸提-鉬銻抗比色法;速效鉀用 1 mol/L NH4OAc 浸提-火焰光度法。土壤蔗糖酶活性(S-SC)用 3,5-二硝基水楊酸顯色法測定，活性以 24h 內 1g 土中葡萄糖的毫克數表示;土壤脲酶活性(S-UE)用苯酚鈉次氯酸鈉顯色法測定，活性以 24h 內 1g 土中 NH4+ -N 的毫克數表示;土壤過氧化氫酶活性(S-CAT)用高錳酸鉀滴定法測定，活性以每克土中的 0.1mol·L-1 KMnO4 的毫升數表示;土壤纖維素酶活性(S-CL)用 3,5-二硝基水楊酸比色法測定，纖維素酶活性以 72h 內 1g 干土生成葡萄糖毫克數表示。

　　1.4 數據處理

　　采用 Excel 2010、SUS7.05 軟件進行數據整理和統計分析。各處理組間物種差異比較采用 Lefse 分析。利用 R 軟件、Origin 2018b 軟件繪制物種累計曲線、韋恩圖及各分類學組成分布圖，多元分析采用 Canoco 5.0。

　　2 結果與分析

　　2.1 不同耕作方式土壤真菌 OTU 分析

　　不同處理土壤真菌群落共形成有 1724 個 OTU (圖 1)，四個處理共有 392 個 OTU，占總 OTU 數的 22.7%。RT、SS、DP 和 SU 中特有 OTU 分別為 205、193、 201 和 161 個。RT、SS、DP 和 SU 的 OTU 數分別為 993、910、908 和 916。RT 處理 OUT 數最多，DP 最小。此外，RT 和 SS 共有 OTU 為 589，DP 和 SU 共有 OTU 為 541，RT 和 SU 共有 OTU 為 622，SS 和 DP 共有 OTU 為 521，深松、翻耕與秸稈還田措施都降低了土壤中真菌種類數。

　　2.2 不同耕作方式土壤真菌群落α多樣性分析

　　土壤真菌群落豐度( Chao1 和 ACE)表現為 RT>SU>DP>SS，各處理間差異不顯著(表1)。土壤真菌群落多樣性(Shannon和Simpson)表現為SS>RT>SU>DP。與 RT 相比 SS 土壤真菌 Shannon 指數增加了 1.3%。而 SU 和 DP 與 RT 相比分別下降了 1.8%和 13%。秸稈覆蓋能夠增加土壤真菌多樣性，深翻秸稈還田處理土壤真菌多樣性指數顯著最低。

　　2.3 不同耕作方式對土壤真菌群落組成結構的影響

　　子囊菌門和擔子菌門是土壤真菌菌群的優勢菌門，子囊菌門( Ascomycota) 相對豐度最高(圖 2)，子囊菌門和擔子菌門的相對豐度約占菌群的 78.64%～ 85.05%。子囊菌門相對豐度在 SS、SU、RT 中顯著高，相對豐度分別為 67.19%、 68.98%和 69.58，在 DP 處理中相對豐度顯著低，相對豐度為 52.92%。其中，深翻秸稈還田顯著降低了子囊菌門的相對豐度; 與 SS、SU 和 RT 處理相比，相對降低了 21%、23%和 24%。

　　擔子菌門( Basidiomycota)的相對豐度與子囊菌門相對豐度表現出相反的趨勢，擔子菌門在 DP 處理中顯著高，相對豐度為 32.13%，而在其他處理中相對豐度為 11.45%～14.21%，免耕、深松和秸稈覆蓋處理顯著降低了擔子菌門的相對豐度。被孢霉門 ( Mortierellomycota) 的相對豐度處于 8.46%～14.94%之間，在 SU 中顯著最高，其次為 SS 處理(P<0.05)。未能歸類的真菌(Unassigned)在 RT 中顯著高，在 SS 中次之。球囊菌門(Glomeromycota)在 RT 和 DP 中顯著高，相對豐度為 3.98%和 3.74%，在 SU 中相對豐度為 0.76%，在 SS 中 0.14%。不同處理下“其他真菌”的相對豐度較低，僅占 0%～0.24%之間。

　　子囊菌門真菌主要 由糞殼菌綱( Sordariomycetes )、 座 囊 菌 綱 ( Dothideomyce-tes) 、盤菌綱( Pezizomycetes) 、錘舌菌綱( Leotiomycetes)和散囊菌綱( Eurotiomycetes)組成 (表 2) 。不同處理下糞殼菌綱(Sordariomycetes)的相對豐度 17.2%～34.7%，在 DP 中顯著低，相對下降了 49%～51%。座囊菌綱的相對豐度為 12.2%～15.4%，盤菌綱( Pezizomycetes)的相對豐度在 11.4%～ 13.9%，各處理間差異不顯著。錘舌菌綱 ( Leotiomycetes)的相對豐度在 RT 處理中顯著低，在 DP 處理中顯著高，DP 與 RT 處理相比錘舌菌綱( Leotiomycetes) 的相對豐度相對增加了 54.2%。散囊菌綱( Eurotiomycetes)的相對豐度在 SU 中顯著最高，在 DP 中最低，各處理間差異顯著。擔子菌門真菌主要由銀耳綱 ( Tremellomycetes)和傘菌綱( Agaricomycetes)構成。銀耳綱是各處理中的優勢菌綱，其相對豐度在 10.7%～30.4%。傘菌綱的相對豐度則顯著下降，相對豐度僅占真菌總數的 0.25%～1.27%。與 RT 相比，DP 處理顯著提高了銀耳綱的相對豐度(P<0.05)，傘菌綱 ( Agaricomycetes)各處理間無明顯差異。被孢霉門(Mortierellomycota)中被孢霉綱(Mortierellomycetes)為優勢菌，相對豐度為 8.46%～14.94%，在 SU 中最高，SS 中次之，各處理間差異顯著。未分配菌門(Unassigned)中未分配菌綱(Unassigned)在 RT 處理中顯著高，相對豐度為 10.43%。球囊菌門(Glomeromycota)中球囊菌綱(Glomeromycetes)為優勢菌群，各處理間差異不顯著。

　　2.4 不同耕作方式土壤真菌群落結構的差異

　　不同耕作方式在各分類單元形成了顯著差異變化 (圖 3) 。在門水平上，擔子菌門(Basidiomycota)的相對豐度在 DP 處理中顯著高，與其他處理均存在顯著差異; 球囊菌門(Glomeromycota)的相對豐度在 RT 中顯著高與其他處理均存在顯著差異。不同處理形成了具有顯著差異類群的真菌微生物群落。通過組間群落差異( LEfSe) 分析，對不同處理產生顯著影響的真菌物種類群共有 79 類。4 個處理間具有顯著差異的真菌類群 40 個(圖 4)。其中，對 DP 處理起重要作用的類群有 11 個，包括擔子菌門(Basidiomycota)、久浩酵母屬(Guehomyces)、囊絲擔子菌目(Cystofilobasidiales)目、囊絲擔子菌科(Cystofilobasidiaceae)等 11 個類群。SS 中起重要作用的類群有 Vibrisseaceae 科、Phialocephala 屬、列殼屬(Schizothecium)等 8 個類群。對 SU 處理起重要作用的肉座菌目( Hypocreales)、叢赤殼科(Nectriaceae)科、肉座菌科(Hypocreaceae)、木霉菌屬(Trichoderma)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、 赤霉屬(Gibberella)等 14 類。RT 中其重要作用的是糞殼菌目(Sordariales)、莢孢腔菌科(Sporormiaceae)、光黑殼屬(Preussia)、球囊菌門(Glomeromycota)、球囊菌綱(Glomeromycotes)等 7 個類群。

　　在不同處理土壤中寄生真菌中只有植物病原菌(Plant Pathogen)在不同處理中呈現極顯著的差異性，在 SU 處理中顯著高，其次是 SS、DP，在 RT 處理中最低(圖 5)。在不同處理中有 7 類腐生真菌呈現顯著差異，木質腐生菌( endophyte/lichen parasite/wood saprotroph )、 排 泄 腐 生 菌 (dung saprotroph/endophyte/undefined saprotroph) 、 排 泄 腐 菌 / 未 定 義 腐 生 物 (dung saprotroph /undefined saprotroph)在 DP 中顯著高，木質腐 endophyte/lichen parasite/wood saprotroph ) 生 菌 在 RT 中 最 低 ， 排 泄 腐 生 菌 (dung saprotroph/endophyte/undefined saprotroph)在 SU 和 SS 中最低。腐生菌 anima pathogen/undefined saprotroph)、Animal endosymbiont/animal pathogen/undefined saprotroph 在 SU 處理中顯著高。植物腐生菌 dung saprotroph/plant saprotroph 在 RT 處理中顯著高，其次是 SS 中較高。排泄腐生菌(dung saprotroph)在 SS 處理中顯著高，其次是 RT 中較高。與玉米共生的內生菌(Endophyte)和外生菌根(Ectomycorrhizal)在 SS 中顯著高。

　　2. 5 不同處理土壤真菌群落與土壤理化性狀間的多元分析

　　土壤真菌物種組成與土壤 S-CL 顯著相關，與土壤 S-CL、土壤速效鉀、有機質、速效磷、土壤堿解氮組合環境因子顯著相關(表 3)。Ascomycota 菌群與土壤速效鉀含量極顯著相關，與 P 和 S-UE 顯著相關(圖 6)。Basidiomycota 菌群與土壤中 PH 極顯著正相關，與 S-CL 極顯著負相關，與土壤速效磷顯著負相關。 Mortierellomycota 與土壤速效 N、K 顯著正相關。Glomeromycota 菌群與土壤速效 K、S-UE 極顯著負相關，與土壤速效 N 顯著負相關，與 S-CAT 顯著正相關。 Olpidiomycota 菌門與 S-CAT 顯著負相關。Cercozoa 與速效 K 極顯著相關，與 S-UE 顯著正相關。

　　3 結論與討論

　　3. 1 不同耕作措施對土壤真菌豐度和多樣性的影響

　　本研究中，常規處理土壤真菌豐富度顯著高，這與前人研究結果一致，傳統耕有利于某些特定種類微生物的大量繁殖，不利于真菌多樣性的增加[16]。Sun 等 [17]研究發現有機肥會顯著增加土壤真菌多樣性[18]，在本研究中秸稈覆蓋顯著增加了土壤真菌的多樣性，這與秸稈還田有機物料的增加和秸稈覆蓋后土壤有機質、土壤溫度與濕度的增加具有相關關系[19]。深翻秸稈還田模式顯著降低了土壤真菌數量和真菌多樣性，土壤中真菌在土壤中通過菌絲伸長和分枝來繁殖，強烈增加土壤擾動會顯著改變土壤通氣形狀，土壤溫度、濕度以及土壤理化性質，從而降低土壤真菌數量和多樣性[20]。因此旋耕、深松、翻耕和秸稈覆蓋等耕作措施通過改變土壤物理結構、土壤孔隙的通氣性、透水能力等理化性質來選擇不同的真菌類群，導致土壤真菌群落豐度和多樣性顯著變化[21,22]。本研究中，土壤纖維素酶活性與土壤真菌群落顯著相關，而關于纖維素酶活如何指示真菌群落結構還有待進一步研究。

　　3.2 不同耕作措施對土壤真菌群落組成的影響

　　土壤真菌群落是植物殘體的主要分解者，是評價自然或人為耕作干擾下土壤變化的重要指標[23]。農田土壤真菌群落受耕作措施、施肥因素影響顯著[20]。特別是土壤中優勢類群與土壤、作物、栽培模式密切相關。農田退耕后子囊菌門、擔子菌門和接合菌門是農田生態系統中的優勢真菌類群[24]。長期有機和無機肥配施會促使真菌群落組成向子囊菌門、擔子菌門和接合菌門方向演替[25]。而本研究中子囊菌門和擔子菌門為優勢菌門，而接合菌門為成為優勢菌群，其變化規律及其影響因素有待進一步研究。本研究深松和秸稈覆蓋還田后子囊菌門的相對豐度顯著高，高于旋耕和深松不覆蓋處理，而深翻秸稈還田顯著降低了子囊菌門的相對豐度。Boer 等[26]研究指出，保護性耕作與傳統耕作下土壤真菌菌群中子囊菌門均為主導類群，受耕作措施影響小[27]。一定程度的耕作和擾動為子囊菌門提供了適宜的環境，使其更好地利用可降解的作物殘茬，因此菌群豐度較高[25]。子囊菌門屬于土壤腐生真菌，其功能是分解木質化植被碎屑，因此植物種類和秸稈殘茬顯著影響子囊菌門的相對豐度[26]。在本研究中不同處理形成了不同優勢類群的腐生菌群，總體上深松秸稈覆蓋和旋耕處理腐生菌群豐度和種類較高，說明旋耕和秸稈覆蓋影響下的土壤理化環境，例如土壤溫度、濕度可能更利于腐生菌群的生長。本研究中子囊菌門優勢菌綱 Sordariomycetes 在深翻秸稈還田中顯著最低，而在深翻秸稈還田中子囊菌門的 Leotiomycetes 菌綱顯著高，結果與劉紅梅等人的結果不一致[28]，原因是因為不同類型土壤上，耕作措施、施肥種類、還田秸稈量以及歸還方式的不同真菌群落結構會顯著不同[17]。旋耕、深松、深翻和秸稈覆蓋影響了土壤理化環境，最終引起土壤真菌群落結構發生顯著改變，其具體演變機制還需要通過針對具體真菌類群的功能及其與土壤物理化學性質之間的關系來進一步揭示。