結核病（TB）為結核分枝桿菌（Mycobacteri－umtuberculosis）引起的慢性傳染病，據WHO估計，目前全世界約有1/3的人受到結核菌感染，每年新發病例800萬，死亡人數達200萬（Kochi，1991）。我國結核病疫情非常嚴重，為全球結核病高負擔國家之一，現有結核病患者451萬，其中菌陽肺結核病人200萬，耐藥結核病占27.8%，多重耐藥結核（MDR-TB）為10.7%（端木宏謹，2002；劉紅宇等，2002）。目前標準的結核病療法周期長且較為復雜，對于免疫抑制的患者效果不好，所以迫切需要發現新的抗結核藥物先導化合物，開發能有效治療MDR-TB和潛伏性結核桿菌感染、縮短治療周期的藥物（Nayyaratal，2005；Lluis，2005）。

海洋微生物是重要藥物資源（Wagneretal，2002；Kelecom，2002；Prokschetal，2002）。紅樹林是熱帶、亞熱帶潮間帶陸海交匯的海灣河口地區特有的生態系統，其特點是咸淡水交迭，規律性地受到海水浸泡和露空，這一特殊的生態環境造就了豐富而特有的微生物資源（林鵬，1997），被認為是分離放線菌的理想環境（Jensenetal，1995；閆莉萍等，2005；張喬民等，1997），陳華（2006），劉穎（2007）對從海南、廣西與廣東三省的紅樹林區廣泛采集紅樹林生態環境中的各種生物樣品如土壤、植物的根、葉和果，紅樹林底棲動物等，采用分離純化后的微生物或不經分離的混合微生物發酵培養，進行抗金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），白色念珠菌（Candidaal－bicans）、黑色素瘤B16及子宮頸癌Hela等細胞毒活性等篩選，證明紅樹林微生物是很好的藥物資源，同時還得出土壤樣品來源的活性放線菌比例要高于根、葉、果及底棲生物樣品來源的活性菌株比例。肖靜等（2008）從福建漳州紅樹林保護區采集土壤樣品中分離到163株放線菌，用5種指示菌和3種腫瘤細胞測定它們的抗菌活性和抗腫瘤活性，結果表明，其中42.3%的放線菌發酵液具有單一或多種抗菌活性，37.4%的放線菌發酵液具有單一或多種抗腫瘤細胞毒活性。以上這些實驗結果，都顯示了紅樹林土壤放線菌有巨大的藥用潛力。但是，關于紅樹林土壤放線菌抗分枝桿菌潛力從未被過報道。

本研究采集了廣東珠海、深圳紅樹林保護區及惠州白沙村、陽江的蓮北村、紅光村、北津村等四個原生態的紅樹林保護區不同紅樹植物根部土壤，對其可培養的放線菌的多樣性進行了初步分離研究，并以天然耐藥的恥垢分枝桿菌（Mycobacteri－umsmegmatis）做指示菌，對分離得到的放線菌進行抗分枝桿菌活性篩選，旨在尋找新型的抗耐藥性結核菌先導化合物。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品

土壤樣品分別采自珠海市淇澳島紅樹林保護區，深圳市福田區紅樹林鳥類自然保護區，惠州市惠東縣鹽洲鎮白沙村，陽江市陽東縣東平鎮蓮北村，陽江市陽西縣程村鎮紅光村，陽江市陽東縣雅韶鎮北津村原生態紅樹林保護區，采樣位置選擇不同紅樹植物根部附近。

1.1.2放線菌分離培養基（朱九濱等，2005）

改良高氏（Gause′）sⅠ號，其中添加重鉻酸鉀作為真菌抑制劑，培養基中還添加了50%陳海水。

1.1.3指示菌及抗分枝桿菌活性篩選培養基（莎姆布魯克，2005）

指示菌：恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmeg－matis），購自中國科學院微生物研究所，篩選時采用的培養基是，LB培養基，LB液體培養基。

1.1.4篩選樣品發酵培養基

用作活性篩選的放線菌采用高氏（Gause′s）Ⅰ號培養基發酵培養，培養基中添加50%陳海水。

1.2方法

1.2.1土壤樣品采集方法（陳華等，2006）

在離目標樹種0.5~1m的范圍內，用經過高壓滅菌的鋼鏟采集離地面5~20cm處的土壤，土壤樣品采集后保存于無菌培養皿中，置于冰上保存，編號，注明采樣時間、地點、植物種類等，于當天運回實驗室分離。

1.2.2放線菌分離純化方法（Hayakawa，2004）

土壤樣品預處理方法：稱取1g新鮮土壤樣品到10ml的無菌水中，加入6%酵母浸膏和0.05%SDS（5mmol/L磷酸緩沖液），于40℃振蕩20min，轉速為200rpm，備用。用移液槍吸取100μl處理好的樣品懸浮液到瓊脂平板上，用無菌玻璃涂棒在培養基表面涂布均勻，并于28℃恒溫培養1~4周，挑取不同放線菌菌落于新的培養基中培養，并對菌株進行劃線純化。

1.2.3篩選樣品制備（Smedsgaard，1997a，1997b）

將分離到的紅樹林放線菌用接種針挑取少許菌體接種到篩選培養基上，室溫下培養約7d以上，將培養基連同菌體全部刮下置于100mL燒杯中，加入100ml甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯混合溶劑（3∶2∶1，v/v/v）超聲提取2次，每次超聲90s，提取液過濾，合并濾液，減壓蒸干溶劑，在浸膏中加入甲醇，配成含量為10mg/mL的待篩選樣品。

1.2.4抗分枝桿菌活性篩選方法（Laietal，2009）

抗分枝桿菌活性篩選采用K-B法：吸取0.5ml恥垢分枝桿菌懸液至小試管，用相對應的液體培養基稀釋到5ml，取100μl稀釋菌液到相應培養基平板上涂布均勻，作為測定平板。取10μl待篩選樣品，滴加在直徑6mm的濾紙片上，把含有受試樣品的濾紙片放入已制好的測定平板上，于37℃恒溫倒置培養1~2d，觀察出現的抑菌圈情況。空白對照采用甲醇。

2結果與分析

2.1放線菌分離結果與分析

本研究樣品的采集地是珠海市淇澳島、深圳市福田區紅樹林保護區以及惠州市惠東白沙村、陽江市的蓮北村、紅光村、北津村這四個原生態紅樹林保護區，涉及到的紅樹樹種有老鼠?（Acanthusilicifolius），白骨壤（Avicenniamarina），無瓣海桑（Sonneratiaapetala），木欖（Bruguieragymnor－rhiza），鹵蕨（Acrostichumaureum），海桑（Son－neratiaeCaseloaris），秋茄（Kandeliacande）l，桐花樹（Aegicerascorniculatum），車桑子（Dodonaeaviscosa（Linn）.），銀葉樹（HeritieralittoralisDryand）.，海芒果（Cerberamanghas），角果木（Ceriopstaga）l，紅海欖（Rhizophorastylosa）等專屬性紅樹植物及苦楝（Meliaazedarach），海漆（Excoecariaagallocha），魚藤（DerrisLou）r等伴生紅樹植物，共采集泥樣45份，獲得放線菌177株，分離結果見表1。