同義替換速率（ｄＳ）或非同義替換的速率（ｄＮ）是一年中或一個世代內一個同義位點上發(fā)生同義替換的數目或一個非同義位點上發(fā)生非同義替換的數目。實際上，由于不知道２個序列的分歧時間，因此，習慣上總是考慮一對序列的平均每個同義位點上發(fā)生同義替換的數目或平均每個非同義位點上發(fā)生非同義替換的數目。ｄＳ等于ｄＮ時（即ω＝１），表明沒受到自然選擇；ｄＳ大于ｄＮ時（ω＜１）表明受到負選擇；ｄＳ小于ｄＮ時（ω＞１）表明受到正選擇［１］。光敏色素（Ｐｈｙ）是一類紅光／遠紅光受體，在植物整個生長發(fā)育過程中都起重要的調節(jié)作用［２－４］。Ｐｈｙ分子是由大約１１００個氨基酸殘基的脫輔基蛋白和１個線性的四吡咯環(huán)生色團通過共價鍵鏈接構成。其Ｎ端是光感受區(qū)，包括后色膽素裂解酶亞結構域（Ｂｉｌｉｎｌｙａｓｅｄｏｍａｉｎ，ＢＬＤ）和光敏色素亞結構域（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｄｏｍａｉｎ，ＰＨＹ），ＧＡＦ（ｃＧＭＰ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ／ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅｓ／ｆｏｒｍａｔｅｈｙｄｒｏｇｅｎｌｙａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）結構域包含于ＢＬＤ結構域中，是發(fā)色團結合的部位，高度保守［５－６］；Ｃ端是光調節(jié)區(qū)，光調節(jié)區(qū)域含有２個ＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ）同源重復序列和１個組氨酸激酶類作用區(qū)（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｄｄｏｍａｉｎ，ＨＫＲＤ）。研究表明，ＧＡＦ結構域某些位點發(fā)生突變，可能會嚴重影響脫輔基蛋白和發(fā)色團的結合［７］，從而影響光敏色素的生理功能。試驗的前期研究發(fā)現，在裸子植物ＰＨＹ進化過程中，ＧＡＦ結構域中存在２個正選擇位點［８］，但是并未涉及Ｃ端的其它結構域。ＰＨＹＢ存在于被子植物，和裸子植物中的ＰＨＹＰ同為Ｂ類光敏色素基因。Ｙａｎｇ等［９］和Ｍａｔｈｅｗｓ等［１０］在對被子植物光敏色素Ａ－Ｃ／Ｆ基因以及光敏色素Ｂ－Ｄ／Ｅ基因的分析中檢測到了正選擇。但是Ｙａｎｇ等選用的基因序列有限，每個光敏色素類型只有１條基因序列。樣本的大小可能會影響檢測結果。因此，現在前期研究工作的基礎上，采用１６條光敏色素基因序列，檢測了分別存在于裸子植物和被子植物中同為Ｂ類光敏色素的ＰＨＹＰ和ＰＨＹＢ基因的光感受區(qū)，以期了解這２個基因的光感受區(qū)是否經歷選擇壓力以及經歷同樣的選擇壓力，從而深化對該區(qū)域功能的認識。

１材料與方法

１．１試驗材料

試驗采用了８條裸子植物的ＰＨＹＰ光感受區(qū)序列，８條被子植物的ＰＨＹＢ光感受區(qū)序列進行適應性進化分析。其中被子植物的序列數據以及外類群風兜地錢（ＭａｒｃｈａｎｔｉａｐａｌｅａｃｅａＢｅｒｔｏｌ．ｖａｒ．ｄｉｐｔｅｒａ（Ｍｏｎｔ．）Ｈａｔｔ．）的序列數據取自ＧｅｎＢａｎｋ（序列名稱及登陸號見表１）；裸子植物序列由測序所得，植物材料均采自中國科學院武漢植物園。

１．２總ＤＮＡ提取、ＰＣＲ、克隆和測序

用于ＤＮＡ提取的材料為新鮮的葉片，方法采用改進的ＣＴＡＢ法［１１］。擴增ＰＨＹＰ光感受區(qū)序列采用的引物是根據王靜得到的南方紅豆杉ＰＨＹＰ序列（數據未發(fā)表）和歐洲赤松ＰＨＹＰ的ｃＤＮＡ序列（Ｘ９６７３８）設計，引物為２對（表２），第１對擴增ＢＬＤ結構域的序列，第２對擴增了ＰＨＹ－ＰＡＳ１結構域的序列。測序完成后，光感受區(qū)域序列由這２個部分通過Ｅｄｉｔｓｅｑ軟件拼接而成。每２５μＬＰＣＲ反應體系中包括：模板５０ｎｇ，引物各８ｐｍｏｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶２Ｕ（Ｔａｋａｒａ，大連）和由Ｔａｋａｒａ提供的１０倍ＰＣＲ緩沖液２．５μＬ及２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．５μＬ。聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）在ＢｉｏｍｅｔｒａＰＣＲ擴增儀上進行（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｏ，德國）。ＰＣＲ反應程序為：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃６０ｓ，７２℃９０ｓ，３５個循環(huán)；７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產物在１．０％瓊脂糖凝膠、１×ＴＡＥ電泳液中電泳３５ｍｉｎ（電壓為１２０Ｖ），切下目的片段，用ＱＩＡＥＸＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，德國）柱式ＤＮＡ膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產物。回收所得產物與ＰＭＤ１９－Ｔ載體在４℃下連接１６ｈ，然后轉化導入由大腸桿菌ＤＨ－５α所制的感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞在含有Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ和氨芐青霉素的ＬＢ瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)１２ｈ，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆。至少有３個陽性克隆送至英俊公司，用ＡＢＩ３７７型自動測序儀測序，測序引物為Ｍ１３＋／Ｍ１３－。為了保證測序的準確性，對所得序列的正、反鏈進行測定并加以校準。

１．３數據分析

根據文獻［１２］，對ＰＨＹＰ和ＰＨＹＢ的分析是以地錢類風兜地錢為外類群。序列經ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１［１３］軟件比對，個別位點進行適當人工校正。采用最大簡約法（ＭａｘｉｍｕｍＰａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）構建分子系統(tǒng)樹。空位（Ｇａｐ）被編碼為缺失（Ｍｉｓｓｉｎｇ）。ＭＰ分析使用ＰＡＵＰ［１４］軟件進行，采用如下選項：樹二組重新連接（ＴｒｅｅＢｉｓｅｃｔｉｏｎ－ｒｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ，ＴＢＲ）、啟發(fā)式搜索（Ｈｅｕｒｉｓｔｉｃｓｅａｒｃｈ）、多重性選擇（ＭＵＬＴＲＥＥＳｏｐｔｉｏｎ）、ＡＣＣＴＲＡＮ優(yōu)化和１００次隨機附加的重復。利用自展分析（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，１０００次重復）檢驗各分支的置信度。在該研究中，采用ＰＡＭＬ４［１５］分析方法中的３個模型：分支模型［１６］、位點模型［１７－１８］以及分支－位點模型［１９－２０］進行分析。采用系統(tǒng)發(fā)育分析得到的ＭＰ樹文件，以及該分析中的密碼子矩陣。目的分支在圖１中以字母標出，ω０是背景比率。整個分析采用ＰＡＭＬ４軟件包中的Ｃｏｄｅｍｌ程序完成。

２結果與分析

２．１構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖１是基于裸子植物ＰＨＹＰ和被子植物ＰＨＹＢ光感受區(qū)序列構建的ＭＰ樹，這２個類型的光敏色素分別聚在不同的２個分支。在ＰＨＹＰ分支中，紅豆杉＋白豆杉與香榧＋穗花杉形成姊妹群（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝８３），然后和三尖杉聚在一起（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝９５），池杉和柳杉＋日本柳杉形成一個分支且得到有力支持（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００），該分支同紅豆杉科和三尖杉科聚在一起（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００），共同構成歐洲赤松的姊妹群（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００）。在ＰＨＹＢ分支中，單子葉植物水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＪａｐｏｎｉｃａ）＋高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）形成一個分支，雙子葉植物馬鈴薯（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，ｔｏｍａｔｏ）、楊（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ）、擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）形成另外一個分支，支持率很高（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００）。