作者：朱天輝 單位：四川農業大學

本實驗在2個方面體現創新設計:(1)走出課堂，面向林業生產實際。從生產中發現問題，獲取的實驗材料，更具針對性，理論與實踐緊密結合，增強了學生的興趣和參與意識。(2)實驗材料多樣性，根據農林高校生源多來自農村、學生獲取植物材料較容易的特點，每小組采集的材料來自不同生態區域，實驗結果豐富多樣，學生組別間可相互學到更多的知識，提高了學習效率。

實驗學時與安排

本實驗具有季節性、綜合性和持續性的特點，選擇在春季5～7月，實驗總學時15學時，分5次進行，每次教學指導20min，采用小結實驗進度和答疑方式。學生查閱資料、編制方案及實驗報告不計入學時，根據報告內容和新穎性推薦發表。

實驗方法

1樣品采集與前處理學生實驗前按5人1組分組，通過社會實踐或生源地了解林木病害發生情況，實地采集或郵寄林木病害分離用標本，并填寫好“林木病害調查記載卡(見圖1)”。記載卡記錄病害發生的生態環境因子、林地管理情況，對分析發病原因至關重要。采集標本注上標記后，如不能及時分離，要用塑料袋分類裝好，冰箱中低溫保存備用以防樣品變質。

2培養基制作培養不同的病原菌，要根據它們的需求配制適宜的培養基，對營養有特殊要求的病原菌還要配制特定的選擇性培養基。培養基的種類很多，截至1930年，已經報道了將近2500種。學生要對所診斷的病害性質有一基本了解，如真菌病害或細菌病害，選擇適宜培養基制作。因此，同學們在實驗設計時應選擇馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基分離真菌或肉汁凍培養基分離細菌。由于該步驟要加熱和高壓蒸汽滅菌，有一定危險性，除安全教育外，還要求學生不能在滅菌期間離開實驗室。馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基制作時，先將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切碎，加水1000ml煮沸0.5h，用紗布濾去馬鈴薯，再加水補足1000ml;然后加葡萄糖或蔗糖10～20g和瓊膠17～20g，加熱使瓊膠完全熔化后，趁熱用紗布或脫脂棉過濾，或者用濾紙和保溫漏斗過濾。而后分裝試管，加棉花塞后滅菌。作平板培養的每管約10ml，作斜面培養的則每管約5ml。根據工作需要，還可以分裝在三角瓶中滅菌。教師必須在實驗前說明，高壓滅菌器的用法和注意事項:(1)滅菌器中的水，應加水到指定的標度;(2)需要滅菌的器物放在滅菌器內，將蓋密閉，打開氣門;(3)加熱，等空氣完全排除后(蒸汽從氣門有力地沖出)，關閉氣門;(4)當壓力上升到所需要的指標后，開始計算滅菌的時間，滅菌過程中保持壓力不變;(5)達到需要滅菌的時間，停止加熱，稍微打開氣門，排出蒸汽使壓力慢慢下降;(6)當壓力降到內外相等時，才能打開高壓滅菌器的蓋。肉汁凍培養基的方法:取3g牛肉浸膏，蛋白胨5～10g，瓊膠17～20g，水1000ml，與馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基的方法相同，這里不再贅述。

3分離培養(1)超凈工作臺清毒與分離材料的選擇。分離和培養應該在很清潔的條件下進行。打開超凈工作臺紫外燈滅菌30min，殺死空氣中的微生物，關燈5～10min，再進行分離。(2)組織分離法分離真菌。病原真菌的分離一般都是用組織分離法［3］，是林學、森保專業學生必須掌握的技術。要求學生從上述采集的標本中，選擇新近發病的植株、器官或組織作為分離的材料，可以減少腐生菌的污染。腐生菌容易在生病很久而已經枯死或敗壞的部分滋生，所以一般斑點病害應該從鄰近健全的組織的部分分離。在超凈工作臺上，從病斑切取每邊約5mm的小塊病組織，用70的酒精浸幾秒鐘，再在0.1的酸性升汞水溶液中浸3～5min;而后用滅菌水換洗3次，將其移置在上述馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基平板上培養。用蠟筆在培養皿上注明分離材料日期后送入25℃溫箱反轉培養皿培養;3～5d，在培養基上選擇純的菌落，移植到新的平面上或斜面上培養并純化，并計算各分離真菌百分率。以優勢菌群作為回接實驗菌種。(3)平板劃線分離法分離細菌。平板劃線法［3］是分離細菌的常見方法，取小塊病組織，經過表面消毒和滅菌水洗過2次以后，放在滅菌載玻片上的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間，用滅菌的移植環蘸取以上組織液在肉汁凍培養基瓊膠平板上劃線培養;先在平板的一側順序劃3～5條線，再將培養皿轉60°，將移植環滅菌后，從第2條線末端，順序劃出3～5條線。也有其他劃線的形式，如4分劃線和放射劃線等，目的都是使細菌分開形成分散的菌落，并計算各分離細菌百分率，以優勢菌群作為回接實驗菌種。

4病原回接與再分離病害的種類很多，其傳染方式也各不相同，因此要用相應的接種方法。種子、土壤、氣流和昆蟲等傳染的病害，接種方法是不同的。因此，指導老師要求學生在進行試驗前，對一種病害在自然條件下的傳染方式和侵染途徑有所了解。一般氣流和雨水傳播病害較普遍，可采用噴霧法進行。將上述真菌孢子(或菌絲)懸浮液噴灑在寄主表面，并用濕紗布保濕3d，病菌可以從氣孔、傷口或表皮直接侵入。影響接種試驗的因子包括病原物的致病性和致病力、接種植物的抗病性和感病性和發病的環境條件。在接種時，應盡量模仿接種菌在自然條件下，侵染寄主時的環境條件，特別要注意溫度和濕度對接種發病的影響。學生在回接后，每隔2～3d觀察病害發生情況并與自然狀態比較，等出現顯著癥狀后按上述方法能再次分離到用來回接的病原，否則實驗失敗。

5病原鑒定與病因分析(1)病原真菌:以形態學特征［4］為主，結合分子生物學［5］鑒定種群。(2)病原細菌:形態、生理生化結合分子生物學［6］鑒定種群。實驗要求學生根據優勢菌群、回接試驗情況與采樣地環境狀態分析發病因素，寫出實驗報告，并進行課程討論。

6創新實驗設計小結本創新實驗流程簡單總結為:在采樣及前處理基礎上，完成“分離、接種、再分離”的技術規程。(1)分離:從病組織上分離病原物并進行純培養;(2)接種:用純培養物接種到相同的健康植物上，給予適宜發病條件，觀察是否引起原來相同的病害;(3)再分離:從接種后發病的植物上，能分離到與用來接種的病原物。

結束語

實驗設計15學時，分5階段完成，占森林保護系列實驗近一半學時，實驗綜合運用《林木病理學》、《林木病害研究方法》、《微生物學》、《分子生物學技術》等課程內容，屬于我校綜合型實驗、探索型實驗、研究型實驗的代表，是理論基礎與面向林業生產相結合的有效形式，這種創新實驗方式應是高等農業院校教學實踐［7－8］的發展方向。通過該實驗同學們在實施前主動利用課余、假期社會實踐活動，了解生產中亟待解決的林木病害問題，為實驗設計開展前期工作，目的性、針對性強。本實驗已實施5年，涉及林學、園林及觀園專業學生。目前有30名學生的實驗報告作為林木病害診斷書提供給了地方林業部門作為制定防治方案的決策依據，有15名學生的實驗論文已正式發表。學生在實驗報告和課程討論中總結到:“人工誘發診斷技術是學好《森林保護系列實驗》和《林木病理學》課程的綜合體現，通過實驗，不僅提高了自己的實踐操作能力，而且解決了一些生產的實際問題，很有成就感”。作為指導實驗的教師在豐富了教學內容的同時，獲得了更多科學研究素材，實現了學與教的雙贏。