材料與方法

1.材料與儀器

保加利亞乳桿菌（L.bulgaricusFn009）本實驗室保存；GOS、XOS本實驗室提供；PI（碘化丙啶）sigama公司；DTNB（二硝基苯甲酸）sigama公司；H2O2、Vc（抗壞血酸鈉）、FeSO47H2O、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、MTT（噻唑藍）、二甲亞砜、檸檬酸三鈉、疊氮鈉、GSH（還原型谷胱甘肽）、偏磷酸等試劑均為國產分析純。總超氧化物酶歧化酶（T-SOD）試劑盒南京建成生物工程研究所。Delta320pH計上海梅特勒-托利多儀器有限責任公司；FA1004A電子天平上海精天電子儀器有限公司；超級恒溫水浴箱上海市化學儀器總廠；5804R型臺式高速冷凍離心機德國艾本德生物技術有限公司；QL-901漩渦混勻器江蘇海門其林醫用儀器廠；MultiskanMk3酶標儀美國Thermo公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療儀器儀表廠；超凈工作臺蘇凈集團安泰公司；FACSCalibur流式細胞儀美國BD公司；隔水式恒溫培養箱上海市躍進醫療器械廠；微量分光光度計spectrophotometer上海琪特分析儀器有限公司；7900HTfast實時熒光定量PCR儀美國ABI公司。

2.實驗方法

1）.乳酸菌活化：實驗室甘油保存（-70℃）的乳酸菌接種到MRS瓊脂培養基活化，挑取單菌落接種于MRS液體培養基深層培養過夜（18h，37℃）。2).乳酸菌耐H2O2能力的測定：收獲培養至12h的乳酸菌菌體，利用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）清洗三次，重新懸浮在PBS中調整菌體濃度至107CFU/mL。取5mL菌懸液沸水浴15min，制備死菌懸浮液作為陰性對照組。按表1加入試劑，37℃孵育，每隔2h取100μL菌懸液加入96孔板，加入5mg/mL的MTT20μL，振蕩混勻37℃反應2h，加入100μL二甲亞砜混勻后測定OD570nm吸光度。3).FCM檢測乳酸菌細胞膜完整性：乳酸菌在MRS培養基上發酵至對數中期，收集菌體，調整濃度至106CFU/mL。實驗分組及試劑添加順序同表1（H2O2終濃度：2mM；低聚糖終濃度為20mg/mL），置于37℃孵育2h后離心收集沉淀，加入PI溶液，終濃度為50μg/mL，冰浴避光染色30min，上流式細胞儀測定，在488nm激發光激發下，波長630nm處檢測熒光信號。以相同濃度活菌懸液設“門”，FL2-H表示熒光強度，Counts表示細胞頻數，M1表示細胞膜完整的細胞比率，M2表示細胞膜破損的細胞比率，每個樣品收集10000個細胞，用CellQuest軟件進行數據分析。4).乳酸菌抗氧化酶活測定：配制新鮮的MRS培養基記為H2O2組，以GOS和XOS分別取代20%葡萄糖的MRS培養基記為H2O2+GOS組和H2O2+XOS組；在MRS培養基中添加0.01%Vc記為H2O2+Vc組，分別接種1%乳酸菌，培養3h后，添加H2O2（終濃度：2mM）建立氧化應激模型，以不添加H2O2的MRS為正常組。發酵至對數中期，4800r/min離心10min，收集菌體，用PBS清洗三次，調整菌體濃度為108CFU/mL，300W冰浴超聲破碎10min，破碎液10000r/min離心10min，收集上清，即為無細胞提取物。按照T-SOD試劑盒說明書測定乳酸菌無細胞提取物超氧化物歧化酶活力（U/mgprot），利用DTNB直接顯色法[7]測定無細胞提取物的GSH-Px酶活力（U/mgprot），蛋白濃度采用考馬斯亮藍法[8]進行測定。5).乳酸菌應激蛋白基因表達的測定：收集1.2.4氧化應激模型中發酵至對數中期的乳酸菌菌體，利用121℃滅菌的DEPC（焦碳酸二乙酯）水洗滌三次，4800r/min離心10min，收集菌體，提取RNA。利用熒光定量PCR技術檢測氧化應激狀態下低聚糖對三株乳酸菌抗氧化脅迫基因和通用應激蛋白基因表達水平的影響。本實驗所選相關基因的引物由上海捷瑞公司設計并合成，引物序列見表2。6).數據處理與統計分析使用：SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、用Turky法進行多重比較和差異顯著性檢驗，結果以平均數標準偏差（XSD）表示。

結果與分析

1.低聚糖對乳酸菌抵抗H2O2能力的影響：過氧化氫是研究氧化脅迫的常用介質，乳酸菌對H2O2具有較高的敏感性，近期研究發現，保加利亞乳桿菌極易遭受H2O2或其他活性氧（ROS）攻擊，形成氧化損傷，造成生長停滯甚至死亡[9-10]。圖1顯示，乳酸菌在H2O2脅迫下，活菌率不斷下降，H2O2孵育8h后活菌率下降至20%左右。GOS和XOS干預6h后乳酸菌活菌率顯著高于相同時間點的H2O2組（p<0.05），但仍顯著低于正常組（p<0.05）。說明GOS和XOS能夠增強乳酸菌對H2O2脅迫的抗逆性，提高氧化脅迫條件下的存活率。

2.氧化脅迫條件下低聚糖對乳酸菌細胞膜完整性的影響：乳酸菌遭受氧化脅迫時，細胞膜上的蛋白質、脂類等容易發生氧化損傷，細胞膜的完整性和功能性遭到破壞，最終導致菌體死亡。圖2顯示，正常組菌體細胞膜完整率為98%，死菌懸液設置的陰性對照組細胞膜破損比率為97%，H2O2組乳酸菌PI染色率高達79%，細胞膜完整菌體的比率僅為17%，說明H2O2脅迫能夠造成乳酸菌細胞膜氧化損傷，細胞完整性受到破壞。GOS和XOS干預組，乳酸菌細胞膜完整率分別為34%和30%，較H2O2組分別提高了17%和13%。從以上數據可以看出，GOS和XOS干預能夠減弱H2O2對乳酸菌細胞膜的氧化損傷程度，對菌體細胞膜具有保護效應。

3.氧化脅迫條件下低聚糖對乳酸菌抗氧化酶活力影響圖：3表明，H2O2組乳酸菌的谷胱甘肽過氧化物（GSH-Px）和總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力較正常組顯著下降（p<0.05），說明H2O2脅迫能夠造成乳酸菌抗氧化酶活力的顯著下降（p<0.05）。GOS和XOS干預后乳酸菌GSH-Px活力較H2O2組均有所升高，但XOS干預組差異不顯著（p>0.05），兩者仍低于Vc干預組和正常組；GOS和XOS干預后乳酸菌的T-SOD活力較H2O2組顯著升高，但仍顯著低于Vc干預組和正常組（p<0.05）。說明氧化脅迫條件下，GOS和XOS干預能夠提高乳酸菌的抗氧化酶活力，但低聚糖作用效果低于Vc。
2.4H2O2脅迫下低聚糖對乳酸菌應激蛋白基因表達水平的影響：乳酸菌在遭受環境脅迫（如極端溫度、pH、滲透壓、氧和饑餓等）時，會啟動相應的應激感應系統和應激防御系統，誘導相關基因進行調節[11]，產生應激保護作用，這些應激反應可以提高乳酸菌在環境脅迫下的存活能力。對乳酸菌的蛋白質組學研究表明，乳酸菌在環境脅迫時可以誘導產生多種應激蛋白，其中Dnak、GroEL和Gsp65伴侶蛋白可以被多種脅迫條件所誘導[12-13]，屬于通用應激蛋白，能夠參與DNA和蛋白質修復。損傷修復是抵抗氧化和其他脅迫的基本機制[14]。圖4表明，在H2O2脅迫條件下，乳酸菌的應激蛋白基因表達量較正常組顯著提高（p<0.05），其中，Dnak熱激蛋白基因表達量上調近80倍，GroEL和Gsp65應激蛋白基因表達量分別上調了20倍和13.3倍，說明H2O2脅迫能夠導致乳酸菌應激蛋白基因顯著上調（p<0.05）。GOS和XOS干預后三種應激蛋白基因的表達量較H2O2組顯著降低（p<0.05），但仍顯著高于正常組（p<0.05），說明GOS和XOS能夠減弱H2O2對乳酸菌的氧化脅迫程度，降低乳酸菌的氧化應激反應。