前言

20世紀70年代，Garrison等首次在生活廢水中檢測到了藥物成分，引起社會上的廣泛關注。隨后，在污水處理廠、河流、湖泊、海洋、甚至飲用水中都檢測到了不同的藥物化合物［1］，如抗生素、降壓藥、降脂藥、止痛劑、抗抑郁藥、β受體阻滯藥、抗癌藥等。在歐洲，進入到環境中的藥物活性成分已有4000余種［2］。這些藥物活性成分對水環境生態安全和人體健康已構成威脅［3］。

四膜蟲是一種單細胞原生動物，是毒理學與生態毒理學研究中的優良模式生物之一，并已廣泛應用于藥物、無機物、有機物的毒理學評價［4－6］。Bamadad等［7］在研究多環芳烴(PAHs)對四膜蟲的毒性損傷時，發現四膜蟲有類似于普遍存在于哺乳動物腫瘤細胞上、與腫瘤細胞耐藥性有關的MDR泵，免疫細胞化學研究結果也進一步證實了這一點。

卡培他濱(CAP)，即5'－脫氧－5－氟－N－［(戊氧基)羰基］胞啶，是一種對腫瘤細胞有選擇性活性的口服細胞毒性制劑，在體內可被代謝為5－氟尿嘧啶(5－FU)，從而發揮抗腫瘤作用。卡培他濱的代謝物中，除了5－FU，其它物質在體外試驗中均不具有細胞毒性。CAP、5－FU及其它代謝物主要通過腎臟排出，其中2.9%是以CAP原形排出(圖1)。根據IMSHealth2007的統計，2006年，CAP在歐洲的使用量為28827kg。由于使用量大，加之易溶于水(LogKow為4．5，Roche2008)，因此CAP及其代謝物對水生生態的影響不容忽視。目前對于環境中CAP殘留的生態毒性數據極為缺乏，最近有報道指出，CAP對羊角月牙藻有很強的毒性，72h－ErC50為2.0mg/L［8］。而研究CAP對其他模式生物如四膜蟲等影響的報道較為罕見。

本文以四膜蟲為模式生物，研究了CAP對嗜熱四膜蟲細胞的生長以及多藥耐藥性(MDR)的影響，嘗試探索CAP的生態毒性問題，為其科學管理提供依據。

1材料和方法

1．1試驗用四膜蟲和培養液

嗜熱四膜蟲(TetrahymenaThermophila，SB210)由中國科學院武漢水生生物研究所饋贈。培養液:胰蛋白胨10g，酵母提取物1g，葡萄糖2g，溶于1L蒸餾水中。攪拌使其充分溶解后分裝于10mL試管和250mL錐形瓶中，用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min，冷卻后于4℃保存。

1．2試劑與儀器

胰蛋白胨和酵母提取物均為Oxide公司產品，葡萄糖(AR，購自國藥集團化學試劑有限公司)，羅丹明(RhodamineB，Sigma－Aldrich，購自于DAHU)。自動手提式滅菌鍋(YXQ－LS－18S，上海博訊)，光照培養箱(SPX－250B－G，上海博訊)，多功能酶標儀(ThermoVarioskanFlash)，DSH－系列超凈工作臺程控儀(上海淀山湖凈化設備廠)，高速離心機(3K30，Sigma)。

1．3四膜蟲的培養

接種于裝有5mL無菌培養液的試管中，置于恒溫培養箱中30℃培養48h，隨后移取試管中的培養液至250mL錐形瓶中，進行擴大培養，達到對數生長期時即可進行后續實驗。

1．4四膜蟲濃度與OD值的關系

移取對數生長期的四膜蟲細胞液200μL至1.5mL離心管中，加入200μL1%的甲醛進行固定。在顯微鏡下用原生動物計數框計數，每個樣品平行計數5次，最后取平均值，并計算出四膜蟲細胞濃度。移取已知濃度的四膜蟲細胞懸液，稀釋不同倍數。用96孔板讀數，并繪制四膜蟲濃度與OD值關系曲線。

1．5CAP對四膜蟲的毒性試驗

在裝有45mL無菌培養液的錐形瓶中，加入50μL不同濃度的CAP溶液，并接種5mL預培養至對數生長期的嗜熱四膜蟲培養液，使CAP終濃度為0.25、1、4、16μM，每個濃度設置3個平行，另設無CAP的對照。30℃培養。在不同培養時間取培養液于96孔板讀數，測定OD值，并根據四膜蟲濃度與OD值關系曲線，計算出相應的四膜蟲濃度。

1．6CAP對四膜蟲多藥耐藥性的影響試驗

移取10mL對數生長期的四膜蟲培養液于已滅菌的離心管中，分別加入10μL不同濃度的CAP溶液和10μL羅丹明B溶液(濃度為3mM)，使CAP終濃度為2和16μM，以CAP濃度0μM為對照，每個濃度設置3個平行。在恒溫培養箱中30℃黑暗培養不同時間，離心收集細胞(1000g，6min)，并用pH為7.4的冰PBS洗滌3次，棄上清液，凍融3次以破碎細胞，隨后加入1mLPBS，室溫下12000rpm離心6min，取上清液加入96孔板，每孔加100μL。用多功能酶標儀測定熒光強度，激發波長540nm，發射波長590nm。

2實驗結果與討論

2．1四膜蟲濃度與OD值關系曲線

四膜蟲濃度與OD值關系曲線見圖2，方程為y=0．0292x+0．051，R2=0．9891。2．2CAP對四膜蟲的生長抑制作用四膜蟲在培養24h后進入對數生長期，細胞濃度明顯增加，48h后進入穩定期。在36h內，不同測試濃度的CAP(0.25、1、4、16μM)對四膜蟲的生長幾乎無影響(見圖3);在48h，CAP濃度為16μM組與對照組相比四膜蟲濃度較低;但在隨后時間內，CAP濃度為16μM組的四膜蟲細胞濃度快速增加。總體而言，在實驗藥物濃度范圍及暴露時間內，未觀察到CAP對四膜蟲的生長有明顯抑制。說明CAP對四膜蟲細胞的毒性作用不大，這有可能是因為進入四膜蟲體內的CAP被四膜蟲的MDR泵排出體外。

2．3CAP對四膜蟲多藥耐藥性的影響

在一定體積的四膜蟲懸液中加入羅丹明B，黑暗中培養不同時間，測定四膜蟲體內羅丹明B的積累(見圖4)。隨著培養時間的增加，四膜蟲體內羅丹明B的熒光強度明顯增強。相同培養時間內，藥物濃度為2μM組的熒光強度略高于對照組和藥物濃度為16μM組。說明CAP對四膜蟲體內染料的排出機制有一定影響，但不顯著。CAP作為抗癌常用藥物，只有在體內被代謝為5－FU時才發揮相應作用，而CAP本身并不能抑制腫瘤細胞的MDR。通過CAP對羅丹明B在四膜蟲體內積累的試驗可以證實，CAP對四膜蟲的MDR的影響亦不顯著。