原位生態(tài)修復(fù)技術(shù)是利用沉水植物在養(yǎng)殖塘中的控藻增氧效應(yīng)，對養(yǎng)殖塘中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收同化作用，并應(yīng)用魚、草、蟹、蝦、貝等構(gòu)建水域生態(tài)系統(tǒng)，完善食物鏈網(wǎng)，同時提供天然飼料和水生動物棲息地，改善養(yǎng)殖塘環(huán)境；結(jié)合異位生態(tài)處理塘、養(yǎng)殖工藝特點進一步削減養(yǎng)殖污水排放，同時從水產(chǎn)養(yǎng)殖健康生態(tài)系統(tǒng)角度分析，發(fā)揮水域生態(tài)系統(tǒng)功能，形成生態(tài)化健康養(yǎng)殖模式［１－２］。而浮游細菌是水生態(tài)系統(tǒng)的分解者和小型濾食性動物的餌料，在湖泊生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中具有重要的作用，水質(zhì)的優(yōu)劣、水體生態(tài)狀況的改變都會對細菌群落的組成產(chǎn)生影響［３］。此外，水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)細菌在物質(zhì)循環(huán)、病害發(fā)生與否及水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的生長、營養(yǎng)和免疫方面都產(chǎn)生重要作用，與水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)有關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)研究也有報道，但對于系統(tǒng)微生物狀況的持續(xù)變化以及養(yǎng)殖菌劑對微生物系統(tǒng)影響的報道不多［４－７］。隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展，以基因檢測為基礎(chǔ)的微生物檢測方法在群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)監(jiān)測中具有快速、便捷的優(yōu)點，變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）是目前應(yīng)用較為廣泛的微生物群落結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)檢驗方法之一。筆者除了采用傳統(tǒng)法研究微生物數(shù)量變化之外，還采用ＤＧＧＥ技術(shù)對在養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化開展了較深入的研究，旨在為陸域養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

實驗基地位于江蘇無錫市郊胡埭鎮(zhèn)龍延村直湖港岸邊。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖主要收獲季節(jié)在６—１０月，于２００９年和２０１０年的６月、８月、１０月３個月在無錫直湖港陸域水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)采集水樣，養(yǎng)殖區(qū)包括進水口、蟹塘１號、蟹塘２號、蟹苗塘、魚塘１號、魚塘２號、魚苗塘及甲魚塘８個點（圖１）。

１．２方法

１．２．１環(huán)境細菌的檢測和樣品總ＤＮＡ的提取

采用平板培養(yǎng)法測定異養(yǎng)細菌數(shù)量，用０．２ｍ的聚碳酸酯膜過濾２００ｍＬ水樣富集水中的細菌，采用申能博采的“環(huán)境樣品ＤＮＡ提取試劑盒”進行水樣細菌總ＤＮＡ的提取，具體操作方法參見說明書。

１．２．２ＰＣＲ－ＤＧＧＥ擴增

根據(jù)參考文獻［１０］，采用上海英駿公司合成的引物序列Ｐ３３８ｆＧＣ：５’－ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’和５１８ｒ：５’－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’，用于擴增細菌１６ＳｒＤＮＡ的Ｖ３區(qū)段，片段長度為２３６ｂｐ。擴增總體系為５０μＬ：模板ＤＮＡ４０～８０ｎｇ；１０ｍｍｏｌ／Ｌ４×ｄＮＴＰｓ１．５μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑ酶１μＬ，２０ｐｍｏｌ／μＬ引物各１．５μＬ，１０×擴增緩沖液（含Ｍｇ２＋）５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ補足至５０μＬ。ＰＣＲ擴增條件：９４℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５℃退火３０ｓ，７２℃３ｍｉｎ，３５個循環(huán)；７２℃延伸１０ｍｉｎ。反應(yīng)產(chǎn)物直接用于變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）分析。

１．２．３ＰＣＲ－ＤＧＧＥ凝膠電泳及結(jié)果處理

ＤＧＧＥ凝膠電泳∶所用膠濃度為８％（丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝３７．５∶１，體積比），細菌ｐａｇｅ膠變性梯度５５％～７０％，真核生物變性梯度３０％～５０％，用１×ＴＡＥ作為電泳緩沖液。每孔上樣量５０μＬ。在６０℃，１５０Ｖ電泳３００ｍｉｎ后溴化乙錠染色，紫外凝膠成像觀察。通過ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ軟件將ＤＧＧＥ圖譜照片轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號，運用ＭＳＶＰ軟件對ＤＧＧＥ指紋圖譜的多樣性和相似性數(shù)據(jù)進行計算，用ＳＰＳＳ軟件進行主成份分析（ＰＣＡ分析）。多樣性和相似性的計算方法分別采用香儂威納（Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅ－ｎｅｒ）多樣性指數(shù)和索倫森相似性系數(shù)（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）表示。

２結(jié)果與分析

２．１細菌數(shù)量變化

從異樣細菌變化情況（圖２）可知，養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)的異樣細菌數(shù)量變化波動較大，特別是２個魚塘的細菌數(shù)量波動可達１０倍以上。從圖３也可看出，采用綜合治理技術(shù)的蟹塘１號及蟹塘２號的微生物數(shù)量明顯下降，分別從２００９年的６５００個／ｍＬ及１１０００個／ｍＬ下降到２０１０年的１５００個／ｍＬ和２０００個／ｍＬ，水質(zhì)凈化效果明顯，證明綜合治理技術(shù)確有效果。在其他養(yǎng)殖塘內(nèi)，魚塘的細菌數(shù)量一直較高，最高１７０００個／ｍＬ，兩年的平均值也都在１００００個／ｍＬ上下波動，這可能與養(yǎng)殖密度較高有關(guān)，相對魚苗塘和甲魚塘細菌數(shù)量變化較小，平均值都在５０００個／ｍＬ左右。統(tǒng)計數(shù)據(jù)亦表明，２０１０年的微生物數(shù)量總體低于２００９年同期，這可能與養(yǎng)殖方式的改進以及太湖整體水質(zhì)變好有關(guān)。

２．２水樣細菌的１６ＳｒＤＮＡ多態(tài)性

采用ＤＧＧＥ分析ＰＣＲ產(chǎn)物，均得到若干分離的條帶（圖４）。每個月的電泳圖譜條帶一直在變化，而且每個圖譜中共有條帶并不多見，因此，在不同的養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，微生物的變化非常明顯，很難找到共有的微生物的存在。盡管８個養(yǎng)殖池水是相通的，但每個池內(nèi)的小生態(tài)系統(tǒng)對微生物的影響較大，導(dǎo)致這一變化的出現(xiàn)。

２．３細菌的Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ多樣性指數(shù)

由圖５可見，８個樣點的香農(nóng)威納指數(shù)都在２．０以上，多樣性較好，進水、蟹塘以及魚塘２號的多樣性指數(shù)變化稍大，可能與生態(tài)系統(tǒng)不太穩(wěn)定有關(guān)，而魚苗塘、甲魚塘的多樣性指數(shù)較為穩(wěn)定，聯(lián)系微生物數(shù)量來看，這２個塘的生態(tài)系統(tǒng)較為穩(wěn)定，可能與兩塘受到的外界干擾較少有關(guān)。從圖６可見，２０１０年的微生物多樣性普遍高于２００９年，這也表明，２０１０年微生態(tài)系統(tǒng)情況好于２００９年，也從另一個方面說明水質(zhì)有變好的趨勢。