華癸根瘤菌urtB基因突變株的構(gòu)建與共生固氮表型分析

　　尿素 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體透性酶亞基編碼基因 urtB 可能參與尿素代謝及支鏈氨基酸 轉(zhuǎn)運(yùn);本文旨在獲得實(shí)驗(yàn)證據(jù)闡明 urtB 基因?qū)θA癸根瘤菌結(jié)瘤和固氮的影響，為深入研究 其功能機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

　　《工業(yè)微生物》介紹了工業(yè)微生物的特征與分類、微生物的營養(yǎng)與培養(yǎng)基、微生物的生長、微生物的代謝及調(diào)控、微生物的遺傳變異和育種以及微生物在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、化工、能源、農(nóng)業(yè)等方面的應(yīng)用。

　　【方法】利用生物信息學(xué)分析 urtB 基因的結(jié)構(gòu)特征及生物 學(xué)功能，通過熒光定量檢測 urtB 基因在自生和共生條件下的時(shí)空表達(dá)特征和啟動(dòng)子原位表 達(dá)技術(shù)檢測 urtB 基因組織表達(dá)特征，采用插入突變構(gòu)建 urtB 突變株，通過植物盆栽并結(jié)合 添加氮素處理，檢測與分析突變體的共生固氮表型變化。【結(jié)果】分析表明 urtB 基因?qū)τ诘?素轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要，在共生條件下的表達(dá)水平比自生培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)表達(dá);在成熟根瘤的 固氮區(qū)中大量表達(dá);正確構(gòu)建和篩選獲得了根瘤菌 urtB 突變株;接種 urtB 突變株與野生型 菌株 7653R 相比較，突變體根瘤發(fā)育異常;植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性顯著降 低;添加氮素可恢復(fù)其共生缺陷表型。【結(jié)論】華癸中慢生根瘤菌 urtB 基因可能通過影響根 瘤中氮轉(zhuǎn)運(yùn)或同化，進(jìn)而在根瘤發(fā)育與共生固氮中發(fā)揮重要作用。

　　根瘤菌具有多種多樣的物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)，能夠利用土壤和根際中的各種復(fù)合物[1–2]，如運(yùn) 輸氨基酸的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ABC transporter)等。ABC型尿素轉(zhuǎn)運(yùn)體是典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)， 包括 1 個(gè)錨定基底物結(jié)合蛋白、 2 個(gè)整合膜轉(zhuǎn)運(yùn)亞基和 2 個(gè) ATP 結(jié)合蛋白。該系統(tǒng)是由 urtABCDE基因簇編碼，其中urtA編碼脂質(zhì)錨定尿素結(jié)合蛋白，urtB和urtC編碼整合膜蛋白， 由尿素透性酶的2個(gè)亞基組成，而urtD和urtE編碼ATP結(jié)合蛋白[3]。在藍(lán)細(xì)菌中，urtA、urtB 和 urtE的突變導(dǎo)致藍(lán)細(xì)菌減少尿素的吸收[4]。在缺乏氮素的條件下，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體才會(huì)誘導(dǎo)表達(dá) 和合成，尿素的吸收能力提高3倍以上。但是在有氮培養(yǎng)基中，尿素轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)停止或尿素吸 收也被阻礙。根瘤菌是一種能夠以類菌體形式存在于豆科植物根瘤中的革蘭氏陰性菌，一方 面將氮?dú)夤潭ǔ芍参锼璧矗硪环矫胬弥参锼峁┑奶荚础⒌瓷妗Ｓ醒芯繄?bào)道，

　　在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中，編碼氨基酸透性酶Aap和Bra基因雙突變后，由 于不能利用谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸及天冬氨酸等氨基酸，根瘤菌生長受到明顯影響[5]。 另外，在肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中發(fā)現(xiàn)作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的psa透性酶不僅參與 Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)在系統(tǒng)毒性和抵御超氧化物及過氧化物中發(fā)揮重要作用[6]。特別值得關(guān)注的 是有研究報(bào)道在恥垢分枝桿菌中，在氮饑餓處理?xiàng)l件下，urtB基因上調(diào)表達(dá)19.17[7]。

　　華癸中慢生根瘤菌為我國特色的固氮資源，具有宿主專一性，其宿主為紫云英[8–9]。 7653R 基因組序列已注釋完成，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室 RNA-sequence 和 Microarray 以及建立的共生 固氮子網(wǎng)絡(luò)，urtB、urtD 和 urtE 在共生固氮中均上調(diào)表達(dá)，其中 urtB 基因上調(diào) 16.8，其余 分別為 9.4 和 5.1[10]。本研究利用生物信息學(xué)分析 UrtB 蛋白的結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能，通過 熒光定量和啟動(dòng)子原位表達(dá)技術(shù)檢測 urtB 在自生和共生條件下的時(shí)空和組織表達(dá)特征，采 用插入失活突變技術(shù)構(gòu)建 urtB 突變株，進(jìn)行植物盆栽實(shí)驗(yàn)鑒定其共生表型，以期獲得直接 證據(jù)闡明 urtB 基因在結(jié)瘤和固氮中的重要功能，為深入研究 urtB 基因的功能機(jī)制奠定工作 基礎(chǔ)和科學(xué)思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和質(zhì)粒：本實(shí)驗(yàn)所用供試菌株和質(zhì)粒見表 1。

　　1.1.2 主要試劑及試劑盒：Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、2×Taq Master Mix、限制性內(nèi)切酶、 T4-DNA 連接酶、M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase 抑制劑購自 Ferments 公司和 TaKaRa 公司，瓊 脂糖凝膠電泳 Marker 購自東盛公司，PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒購自上海華舜(Watson)生物 公司，抗生素、培養(yǎng)基相關(guān)組分等分子生物學(xué)常規(guī)藥品及試劑均購自中國國藥集團(tuán)本。研究 所用 PCR 引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，DNA 測序工作由天一輝遠(yuǎn)公司和南 京金斯瑞生物科技有限公司完成。

　　1.1.3 引物：本實(shí)驗(yàn)所用引物見表 2。

　　1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

　　大腸桿菌的培養(yǎng)采用 LB 培養(yǎng)基，在 37 °C 培養(yǎng)。7653R、突變株和定位菌株培養(yǎng)采用

　　TY 培養(yǎng)基，篩選突變株采用 AMS 培養(yǎng)基，在 28 °C 培養(yǎng)。

　　AMS 培養(yǎng)基(g/L)：MOPS 4.19，K2HPO4·3H2O 0.114，NaCl 0.2， MgSO4·7H2O 0.5，加

　　入 1 mL Solution A 和 2 mL Solution B 后，調(diào)節(jié) pH 至 7，1´105 Pa 滅菌 30 min。Solution A (g/L)： EDTA-Na2 15，ZnSO4·7H2O 0.16，NaMoO4 0.2，H3BO3 0.25，MnSO4·4H2O 0.2，CuSO4·5H2O

　　0.02，CoCl2·4H2O 0.001，4 °C 長期保存。Solution B：CaCl2·2H2O 1.28 g (定容至 50 mL)， FeSO4·7H2O 0.33 g (定容至 50 mL)，隨后混勻?yàn)?100 mL，混合溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，混合溶液 4 °C 貯存不超過 1 周。Solution C (g/L)：Thiamine hydrochloride 1，D-Pantothenic acid calcium salt Biotin 2，Biotin 0.001，過濾除菌，4 °C 保存。

　　1.3 urtB 突變株、啟動(dòng)子表達(dá)定位菌株的構(gòu)建及篩選

　　1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以 7653R 菌株基因組 DNA 為模板，urtB-F 和 urtB-R 引物擴(kuò)增同源 交換臂。PCR 反應(yīng)條件：95 °C 5 min，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30 個(gè)循環(huán);72 °C 10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng) DNA 凝膠回收試劑盒回收后連接載體 pMD19-T (Simple)并轉(zhuǎn)化至 DH5α，PCR 驗(yàn)證后將陽性克隆送至南京金斯瑞測序。抽提測序正確的陽性克隆質(zhì)粒和載體 pK19mob 質(zhì)

　　粒[11]。以 Hind III、Xba I 雙酶切陽性克隆質(zhì)粒和 pK19mob，回收雙酶切后的目的片段、載 體，用 T4-DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化至 S17-1。PCR 檢測陽性克隆并將正確的陽性克隆菌株命 名為 urtB-pK19mob。

　　1.3.2 啟動(dòng)子表達(dá)定位菌株的構(gòu)建：通過網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測 urtB 基因啟動(dòng)子序列，PCR 克隆目的片段并連接到 pRG960 載體[12]，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 urtB-pRG960 和空載 pRG960 質(zhì)粒分別通過電轉(zhuǎn)化到 7653R 感受態(tài)中。隨后將通過 GUS 染 色篩選得到的陽性菌株，分別命名為 urtB-promoter 和 pRG960-CK。隨后分別接種在紫云英 根部。之后分別收取 10、17、25、30 d 的根，經(jīng)過簡單清洗后放到 GUS 染液中，37 °C 染 色 3 h 以上，隨后在普通光學(xué)顯微鏡和體式顯微鏡下觀察[13]。

　　GUS 染液：0.01 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.5 mol/L EDTA，0.001%Triton X-100，20%甲醇，

　　0.019 mol/L X-Gluc，0.05 mol/L PBS (pH=7.0)。

　　1.3.3 7653R△urtB 單交換突變株的篩選：以 urtB-pK19mob 為供體菌、7653R 為受體菌，進(jìn) 行兩親本接合轉(zhuǎn)移。將 urtB-pK19mob 導(dǎo)入 7653R，基因通過同源重組交換將質(zhì)粒整合到染 色體上，從而使靶基因失活。采用含有 Str+Neo 的 AMS 選擇性平板上篩選突變體[14]。將篩 選獲得的單菌落轉(zhuǎn)移到含有 Str+Neo 抗性的 TY 平板上，以載體 pK19mob 通用引物 M13-F 與酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的目的基因篩選引物 D 進(jìn)行 PCR 檢測，同時(shí)用野生型 7653R 基因組 DNA 為模板作對(duì)照[15]。

　　1.4 植物盆栽實(shí)驗(yàn)及共生表型的測定

　　1.4.1 植物盆栽實(shí)驗(yàn)：用 75%乙醇清洗紫云英種子表面 5 min，2% (V/V)的 NaClO 溶液表面消 毒 10 min，再用無菌水清洗 8–10 次，徹底洗去 NaClO 殘留，消毒后的種子吸水膨脹 4–8 h 后鋪于無菌素瓊脂平板表面，于 22 °C 培養(yǎng)箱(16 h 光照，8 h 黑暗)中培養(yǎng)約 2–3 d 催芽。催 芽后的種子播種含 Fahareus 無氮植物營養(yǎng)液的無菌沙盆，每組處理 5 株，約 3–5 d 植物幼苗 長出第一片真葉后，在根系接種 1 mL (OD600= 0.5)相對(duì)應(yīng)的根瘤菌懸液，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng) 30 d。另外以 Fahareus 無氮植物營養(yǎng)液為基本營養(yǎng)液和 NH4NO3 配制所需營養(yǎng)液的無菌雙層沙 盆。

　　1.4.2 共生表型的測定：觀察植株長勢并測定地上部分鮮重、瘤數(shù)、瘤重、固氮酶活(乙炔還 原法)測定[17]。

　　1.5 目標(biāo)基因在自生和共生條件下的熒光定量表達(dá)檢測 分別抽提自生條件下培養(yǎng)的華癸中慢生根瘤菌 7653R、接種 7653R 的紫云英 9、12、14、

　　18、21、25、30、45、50 d 根瘤的 RNA，純化后測定 RNA 濃度，均調(diào)至 2000 ng，并進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR 程序：42 °C 1 h;72 °C 10 min。

　　1.6 熒光定量 PCR

　　先用普通 PCR 將內(nèi)參基因亮度調(diào)一致，然后用目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，若條帶單一，大小 正確，再進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測，內(nèi)參基因?yàn)?rnpB。Real-time qPCR 程序：95 °C 5 min; 95 °C 30 s;60 °C 20 s，72 °C 20 s，40 個(gè)循環(huán)。信號(hào)檢測染料使用 SYBR Green，分析相對(duì)表達(dá)量采用 2–△△C

　　1.7 目標(biāo)基因的生物信息學(xué)分析

　　利用 NCBI 網(wǎng)站根據(jù)目標(biāo)基因的 ID 名稱查找編碼蛋白質(zhì)的序列及名稱，然后通過 NCBI Conserved Domain Search 網(wǎng)頁分析靶蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測靶蛋白的功 能;將蛋白序列通過 BLASTp 比對(duì)查找同源蛋白，挑選不同物種的同源蛋白序列，使用 DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白同源比對(duì)分析，使用 Clustal X 和 MEGA7 軟件的鄰位相接法系統(tǒng) (bootstrap N-J Tree)來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

　　2 結(jié)果和分析

　　2.1 urtB 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能分析 基于前期工作基礎(chǔ)，我們分析了系列目標(biāo)基因在共生根瘤中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn) urtB、urtD

　　和 urtE 等在共生固氮條件下均顯著上調(diào)表達(dá)，其中 urtB 上調(diào) 16.8 倍，urtD 上調(diào) 9.4 倍，urtE 上調(diào) 5.1 倍[10–20]。這表明 ABC 型尿素轉(zhuǎn)運(yùn)體在共生固氮中應(yīng)該發(fā)揮重要功能。urtB 基因全 長 1614 bp，編碼 537 個(gè)氨基酸，分子量預(yù)期大小為 56.6 kDa。我們進(jìn)一步在 NCBI 上分析 了 urtB 基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(圖 1)。

　　通過基本的生物信息分析發(fā)現(xiàn)，UrtB 蛋白氨基酸序列包含一個(gè) TM-ABC transporter signature motif 和 urea_trans_UrtB 結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族參與尿素的代謝和循環(huán)。藍(lán)細(xì) 菌中的研究結(jié)果表明該基因缺失造成高親和力尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的缺失[4]。UrtB 在苜蓿根瘤菌 2011 中的同源基因蛋白是 SMb20604，在苜蓿根瘤中該基因在侵染區(qū)、過渡區(qū)和固氮區(qū)均有表達(dá) 其中在侵染區(qū)和固氮區(qū)的表達(dá)量最高。因此，以上分析提示該類基因在根瘤固氮中具有重要 作用。