H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡中circNFIX表達(dá)及作用

　　[摘要]目的 探討環(huán)狀RNA NFIX(circNFIX)在H9c2細(xì)胞凋亡中的表達(dá)趨勢和功能。方法 將H9c2細(xì)胞應(yīng)用200 μmol/L的H2O2孵育0、1、3、6、12 h，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡中circNFIX的表達(dá)趨勢。將H9c2細(xì)胞分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染)、siRNA陰性對照組(轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照組)和siRNA組(轉(zhuǎn)染siRNA)，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測siRNA對circNFIX抑制效果。將H9c2細(xì)胞分為對照組(未轉(zhuǎn)染)、H2O2組(應(yīng)用200 μmol/L H2O2孵育12 h)、H2O2+NC組(先轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照，余處理同H2O2組)和H2O2+siRNA組(先轉(zhuǎn)染siRNA，余處理同H2O2組)，用TUNEL和Western blot方法檢測敲低circNFIX對H9c2細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 circNFIX表達(dá)趨勢檢測顯示，隨著H2O2孵育時間的延長，circNFIX的表達(dá)水平逐漸下降(F=23.677，P<0.01);轉(zhuǎn)染siRNA可顯著降低circNFIX的表達(dá)水平(F=424.70，t=24.44～25.97，P<0.01)。TUNEL和Western blot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA使TUNEL陽性細(xì)胞率和Bax/Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(t=3.27～17.22，P<0.01)。結(jié)論 在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡中circNFIX的表達(dá)水平減低，沉默circNFIX的表達(dá)抑制H9c2細(xì)胞凋亡。

　　[關(guān)鍵詞] RNA，環(huán)狀;過氧化氫;氧化性應(yīng)激;細(xì)胞凋亡;心肌梗死

　　心肌梗死是一種缺血性心臟病，在全球有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。隨著溶栓和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的應(yīng)用，心肌梗死病人的存活率顯著提高。然而，再灌注過程中超氧化物過載和鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞凋亡[3]。凋亡的心肌細(xì)胞將被成纖維細(xì)胞代替，進(jìn)而導(dǎo)致左心室的收縮功能障礙，最終發(fā)展為心力衰竭[4]。因此，亟需研究和明確心肌細(xì)胞凋亡的分子

　　機(jī)制。環(huán)狀RNA是一類閉合環(huán)狀的分子，具有保守性好、穩(wěn)定性高、組織特異性和疾病發(fā)展階段特異性等特征[5]。環(huán)狀RNA有多種生物學(xué)功能，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤等疾病的發(fā)病過程[6-7]。最近研究結(jié)果顯示，環(huán)狀RNA在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]，而其在心肌細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確。本研究探討環(huán)狀RNA NFIX(circNFIX)在H9c2細(xì)胞凋亡中的變化趨勢和作用，為開發(fā)環(huán)狀RNA相關(guān)的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供實驗依據(jù)。

　　1 材料和方法

　　1.1 細(xì)胞與試劑

　　大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司;胎牛血清購于上海吉泰依科賽生物科技有限公司;青霉素/鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR green購于寶生物工程有限公司;Lipfectamine 3000購于賽默飛世爾科技公司;熒光定量PCR引物購于華大基因公司;siRNA和陰性對照(NC)購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司;RIPA裂解液(高強(qiáng)度)、PAGE凝膠快速制備試劑盒(125 g/L)、Omni-ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于上海雅酶生物科技有限公司;Bax、Bcl-2抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司;GAPDH抗體、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞H9c2培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃濕潤的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，應(yīng)用含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素/鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基每48 h更換1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

　　1.2.2 熒光定量PCR檢測環(huán)狀RNA和NFIX mRNA的表達(dá) 用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟參照Trizol試劑說明書。反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃結(jié)束。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△CT法計算circNFIX的表達(dá)水平。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。引物序列見表1。1.2.3 候選環(huán)狀RNA表達(dá)檢測 選擇對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，分為對照組(無藥物處理)、H2O2組(200 μmol/L H2O2孵育12 h)。收集細(xì)胞后，用1.2.2的方法檢測候選環(huán)狀RNA的表達(dá)水平。

　　1.2.4 circNFIX表達(dá)趨勢檢測 取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，分為0 h組(無藥物處理)、1 h組(應(yīng)用200 μmol/L H2O2孵育1 h)、3 h組(200 μmol/L H2O2孵育3 h)、6 h組(200 μmol/L H2O2孵育6 h)、12 h組(應(yīng)用200 μmol/L H2O2孵育12 h)。各組處理相應(yīng)時間后收集細(xì)胞，用1.2.2的方法檢測circNFIX的表達(dá)水平。

　　1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染效果檢測 取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染)、siRNA陰性對照組(轉(zhuǎn)染NC)、siRNA組(轉(zhuǎn)染siRNA)。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipfectamine 3000說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，用1.2.2的方法檢測circNFIX和NFIX mRNA的表達(dá)水平。siRNA序列見表1。

　　NC組(先轉(zhuǎn)染NC，其余處理同H2O2組)、H2O2+siRNA組(先轉(zhuǎn)染siRNA，其余處理同H2O2組)。轉(zhuǎn)染24 h后，除對照組外均加入H2O2(終濃度為200 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。按照TUNEL檢測試劑盒說明書檢測各組TUNEL陽性細(xì)胞率。

　　1.2.7 Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

　　實驗分組及處理方法與1.2.6相同，培養(yǎng)結(jié)束以后加入RIPA裂解液提取總蛋白。各組樣品經(jīng)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗(Bax，1∶500;Bcl-2，1∶500;GAPDH，1∶5 000)

　　4 ℃孵育過夜，然后加入二抗(羊抗鼠二抗1∶5 000;羊抗兔二抗1∶5 000)于室溫孵育1 h，最后用ECL檢測試劑盒顯影。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值表示。

　　以上各指標(biāo)檢測均重復(fù)3次。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

　　使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 環(huán)狀RNA的篩選和circNFIX的表達(dá)趨勢

　　應(yīng)用熒光定量RCR檢測H9c2細(xì)胞凋亡前后候選環(huán)狀RNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，circNFIX在H9c2細(xì)胞凋亡前后變化最顯著(t=17.535，P<0.01)。見表2。因此，選擇circNFIX做進(jìn)一步研究。對circNFIX表達(dá)趨勢的檢測顯示，0、1、3、6、12 h組circNFIX相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.92±0.06、0.84±0.04、0.79±0.05、0.62±0.02。隨著H2O2處理時間的延長，circNFIX的表達(dá)量逐漸減少(F=23.677，P<0.01)，其中12 h組較0 h組減少了48%(t=9.074，P<0.01)。表明在H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡中circNFIX的表達(dá)水平明顯下調(diào)。

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