多重PCR技術可鑒定雜交水稻種子純度

　　摘 要 為建立一種利用多重 PCR 技術對水稻多個基因位點進行同步檢測的方法，本研究以„豐田優 553?、 „吉豐優 3550?及其雜交種子為試驗材料，根據不同 SSR 分子標記的擴增片段差異，篩出親本間差異明顯的 SSR 分子標記，然后設計多重 PCR 鑒定雜交水稻種子的純度，并與普通 PCR 的鑒定結果進行對比分析，驗證多重 PCR 鑒定雜交水稻種子純度實用性。結果顯示，共篩選到 48 對 SSR 分子標記，其中„豐田 1A? 與„桂恢 553?之間的差異性引物有 23 對;„吉豐 A?與„廣恢 3550?之間的差異性引物有 24 對。根據 PCR 擴增片段大小的差異，對兩個雜交組合設計的兩組雙重 PCR 的純度鑒定發現，普通 PCR 的鑒定結果與多重 PCR 的結果一致。說明多重 PCR 能夠對多個水稻基因位點進行同步檢測，為雜交水稻種子純度的鑒定提供技術參考。

　　本文源自馬增鳳; 韋敏益; 黃大輝; 張月雄; 劉馳; 羅同平; 李振經; 秦鋼， 分子植物育種 發表時間：2021-02-23 《分子植物育種》雜志，于2003年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:46-1068/S，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：新技術、新方法 、學術論壇與信息等。

　　關鍵詞 多重PCR; 純度鑒定; 雜交水稻; 同步檢測

　　雜交水稻的成功研究與大面積推廣應用為中國乃至世界的糧食安全做出了巨大貢獻(朱國奇等, 2015)。雜交水稻質量的優劣直接關系到中國乃至世界糧食生產安全，而加強雜交稻種子質量管理是提高中國雜交稻種子質量水平的必經途徑。種子純度為種子質量好壞的衡量標準之一，對種子純度檢測是防止良種混雜退化、提高種子質量和產品品質的必要手段(朱玉君等, 2009; 宗凱等, 2018)。SSR 分子標記在水稻基因組中分布比較均勻，且具有重復性好、穩定性高、成本較低和易于操作等優點，是室內鑒定種子純度最常用的方法(譚智丹等, 2006; 張安寧等, 2013; 王立廣等, 2020)。目前，多重 PCR 檢測多用于病原微生物的同時檢測(謝婷藝, 2017,白菊紅等, 2019)，對于雜交水稻種子純度的檢測尚沒有報道。朱國奇等(2015)采用 SSR 分子標記對 500 家種子企業的 20 000 多份雜交種子的樣本進行純度檢測，大多數結果與大田結果相吻合，但在檢測中發現，有的樣品采用不同的 SSR 引物檢測時結果出現很大的差異。宗凱等(2018)利用多對 SSR 標記引物鑒定兩系雜交水稻的種子純度，結果發現，不同引物對同一樣品的鑒定結果通常存在差異，SSR 標記與田間鑒定結果均接近，相差最大一組差異為 3.3%，最小的差異值 0.04%，因此認為篩選合適的、多對引物同時對同一組樣品進行測定是有價值的，也是有必要的。

　　由于不同的 SSR 引物檢測結果出現很大的差異，采用多對引物的普通 PCR 鑒定又會增加鑒定成本。因此，本研究旨在建立一種利用多重 PCR 技術對水稻多個基因位點進行同步檢測的方法，探討多重 PCR 在雜交水稻品種純度快速鑒定中的應用。為雜交水稻種子純度的鑒定提供技術參考。

　　1 結果與分析

　　1.1 引物間的目標片段大小差異相對較大

　　對 48 對引物進行篩選，„豐田優 553?親本間有 23 對引物差異明顯，„吉豐優 3550?親本間有 24 對引物多態性較好。在篩選出來的親本間有差異的引物中按照帶型比較單一，親本間帶型差異明顯、位于不同染色體，且引物間的目標片段大小差異相對較大(最好在 40-60bp 之間)的原則，選擇多重 PCR 的檢測引物。如圖(圖 1)中所示，引物 A(RM583)與引物 B(RM471)親本差異明顯，兩個引物的目標片段大小差異相對較大，所以可以選擇作為雙重 PCR 的檢測引物;同樣引物 C 與引物 D 也符合這個原則選擇作為雙重 PCR 的檢測引物;引物 A、B 和 D 相互間的目標片段大小差異也相對較大，可以考慮用作三重 PCR 的引物。根據以上原則，最終選擇檢測„豐田優 553?種子純度的引物是：RM583、RM471、RM3331、RM424;檢測„吉豐優 3550?的引物是：RM490、RM471、RM432、RM424。

　　1.2 標準 PCR 和多重 PCR 的比較

　　利用引物 RM432、RM490 分別對樣品„吉豐 A?、„廣恢 3550?、3 個 F1 單株以及 3 個雜株進行擴增，雙重 PCR 采用 RM432 和 RM490 組合對單一 PCR 同樣的樣品進行擴增，三重 PCR 采用 RM432、RM490 和 RM424 組合進行擴增。在圖中 A 部分是引物 RM432 單獨擴增的結果，B 部分是引物 RM490 單獨擴增的結果，C 部分是引物 RM432 和 RM490 雙重 PCR 擴增的結果，圖中 C 部分上半部分的電泳帶型與 A 部分相同，即 RM432 的擴增條帶是一樣的;下半部分的電泳帶型與 B 部分相同，即 RM490 的擴增條帶也是一樣的，且條帶清楚易讀，證明雙重 PCR 并不會影響擴增條帶結果(圖 2)。由于三重 PCR 是三對引物同時進行 PCR 擴增，在電泳圖中擴增條帶會分成三層。從圖中可以看到電泳條帶清晰程度并不一樣，位于上層的 RM424 條帶和位于下層的 RM490 條帶比較清晰，而位于中間位置的 RM432 產生的條帶相對于在雙重 PCR 中形成的條帶就顯得很模糊(圖 3)，且三對引物擴增產生的條帶太多，分析結果的時候讀取帶型相對困難，對鑒定結果容易產生誤判。

　　1.3 雙重 PCR 的穩定性試驗

　　為驗證多重 PCR 在群體中擴增的穩定性，本研究采用兩個雜交品種分別設計 2 個雙重 PCR 的引物組合，并對相應的樣品進行擴增分析(表 1)。結果顯示，每對引物所擴增的產物條帶，不同引物之間互不影響，可以完全區分開。說明在同一反應孔中添加 2 對引物時，PCR 反應穩定性良好(圖 4)。

　　注: M: DL2000 DNA marker; 1: 豐田 1A; 2: 桂恢 553; 3~5: 豐田優 553 F1 單株; 6: 吉豐 A; 7: 廣恢 3550; 8~10: 吉豐優 3550 F1 單株; A: RM583+RM471; B: RM3331+RM424; C: RM432+RM490; D: RM471+RM424 Figure 4 Stability detection Note: M: DL2000 DNA marker; 1: Fengtian 1A; 2: Guihui 553; 3~5: Fengtian 553 F1 single plants; 6: Jifeng A; 7: Guanghui 3550; 8~10: Jifeng You 3550 F1 single plants; A: RM583+RM471; B: RM3331+RM424; C: RM432+RM490; D: RM471+RM424

　　1.4 雙重 PCR 的檢測結果分析

　　為檢測雙重 PCR 在雜交種子純度鑒定中的應用情況，本研究一共檢測了„豐田優 553?和„吉豐優 3550? 288 個樣品。將這些樣品分為 3 組，每組 96 個樣品。每組用 4 對引物將其分成兩個雙重 PCR 組合并分析。結果顯示，在„豐田優 553?的 3 組樣品中(表 2)，樣品 FF1-1 檢測出來的純度為 95.7%，FF1-2 的純度為 97.9%， FF1-3 的純度為 94.8%。檢測結果的最大值與最小值相差了 2.9%。對 4 對引物鑒定出來的平均純度進行分析也發現 RM583 在 288 個樣品中檢測到 7 個雜株，純度為 97.6%;RM471 檢測到 5 個雜株，純度為 98.3%; RM3331 檢測到 7 個雜株，純度為 97.6%;RM424 檢測到 9 個雜株，純度為 96.9%。說明不同批次鑒定的結果是不一樣的，4 對引物鑒定的純度也有 3 種不一樣的結果。

　　在„吉豐優 3550?的 3 組樣品中(表 2)，樣品 JF1-1 檢測出來的純度為 97.9%，JF1-2 的純度為 95.8%，JF1-3的純度為 96.9%。其中，JF1-1 只檢測到了 2 個雜株，而 JF1-3 中有 3 對引物沒有檢測到雜株，最大值與最小值相差 2.1%。對 4 對引物鑒定出來的平均純度進行分析發現：RM471 檢測出來的純度為 99.3%，RM424 的純度為 99.0%，RM432 的純度為 96.9%，RM490 的純度為 98.3%，最大值與最小值相差 2.4%。„吉豐優 3550?的鑒定結果與„豐田優 553?的鑒定結果均說明，不同組合鑒定的結果不一樣，4 對引物鑒定的純度也不一樣。

　　2 討論

　　目前雜交水稻種子純度檢測需要的樣本量還沒有統一的標準。郭承亮(2014)認為，利用 SSR 分子技術檢測雜交種子純度一般要選取 1 000 粒種子檢測，效果較好。對于一些種子，批數量特別大要選取 2 000 粒種子檢測，才能保證檢測結果的準確性;宗凱等(2018)利用 SSR 標記檢測雜交稻種子純度時每個樣選取了 192 粒，總體的鑒定結果與種植鑒定十分接近;吳柔賢等(2018)通過不同樣本量并結合公式則認為 192~288 為合適的檢測樣本量。在本實驗中每個品種分三個批次，每個批次 96 個樣品進行檢測，在„豐田優 553?的純度檢測中的三個批次最大純度與最小純度相差 2.9%，檢測樣品量為 192 個時，通過組合分析計算，最大純度與最小純度相差 1.5%。理論上選取檢測的樣品數量越大檢測效果就越好，誤差就越小，但這無疑增加各個工作環節的工作量，不利于效率提高(吳柔賢等, 2018)，同時也增加了檢測的成本。綜上，如果再增加一板的檢測樣品量(96 個)，也就是 288 個的樣品，檢測的誤差就能控制在 1%左右;如果檢測的品種數太多(大于 10 個)也可以每個品種只檢測 192 個樣品。

　　水稻雜交種子純度鑒定時，應盡可能采用多對引物進行檢測(朱國奇等, 2015; 宗凱等, 2018)。理論上檢測引物數量越多鑒定結果就越準確，但是，考慮到工作量和成本，很多實驗只采用了兩對引物進行檢測，純度鑒定的結果準確率還得不到保證。本試驗采用雙重 PCR 進行檢測，可以成倍地降低成本和工作量，采用 2 個組合 4 對引物對品種的純度進行分析，檢測的結果也有所差別。從檢測結果來看，不同引物對樣品純度的分子生物學鑒別能力不同，采用位于不同染色體區域的多對引物進行檢測，更能保證純度鑒定結果的可靠性(白占兵等, 2012)。多重 PCR 可以對引物同時檢測，不僅減輕了大量的工作量，也節約了檢測的時間和成本。

　　依據本次研究發現，多重 PCR 應用于雜交水稻種子純度鑒定時應注意以下幾個方面： (1)選用的引物應盡量位于不同的染色體上，不同的染色體區域，品種間的遺傳差異不一樣，檢測出來的結果也不一致。本研究用于鑒定„豐田優 553?的引物中，RM424 檢測到的純度最低為 96.9%，RM471 檢測到的雜株最少，只有 5 個雜株，純度為 98.3%，兩者的純度相差是 1.4%;用于鑒定吉豐優 3550 的引物中，RM471 檢測出來的純度最高為 99.3%，RM432 檢測出來的純度最低為 96.9%，兩者相差是 2.4%。由此可見，不同的引物對樣品純度的鑒別能力不同，應盡可能的采用位于不同染色體區域的多對引物進行檢測。(2)三重及以上的 PCR 不適用于雜交水稻種子的純度鑒定。首先，在選擇差異度比較合適的引物就相對困難;其次，三對引物同時擴增時，中間的引物會受到一定的影響，擴增產生的 PCR 條帶比較模糊;再者，三重 PCR 對雜交水稻種子的純度鑒定，擴增出來的條帶太多，加上雜種產生的條帶，一般會產生 6~10 個條帶，檢測結果混亂，容易產生誤判。相對于三重 PCR，雙重 PCR 的效果就好多了，引物組合的選擇也相對容易得多，在 PCR 反應的穩定性，條帶的區分度方面都比三重 PCR 要好。(3) 利用雙重 PCR 檢測雜交種子時，2 對引物同時擴增 2 個親本就會產生 4 條主條帶，另外有些引物還存在擴增出副帶的問題，在這種情況下，因為條帶數量過多，若下層的引物在親本間擴增的條帶差異過大(超過 40 bp)，就會與上層的引物擴增的條帶摻雜在一起，導致無法準確讀帶，因此同一引物在兩個親本間擴增的條帶差異不宜過大，在 5~10 bp 為較佳，同時，不同引物在同一親本間擴增的條帶差異在 50 bp 以上為較佳，在這種情況下，兩對引物擴增的條帶能有明顯的分隔，有利于對鑒定結果的判斷。

　　多重 PCR 能對多個水稻基因位點進行同步檢測，該方法簡單、快速又準確，可以利用于雜交水稻種子純度的鑒定，而相對于三重 PCR，雙重 PCR 更適用于水稻雜交種子的純度鑒定。

　　3 材料與方法

　　3.1 供試材料

　　供試雜交水稻組合為„豐田優 553?和„吉豐優 3550?，„豐田優 553?、母本„豐田 1A?和父本„桂恢 553?由廣西農科院水稻研究所提供，„吉豐優 3550?、 母本„吉豐 A?和父本„廣恢 3550?由廣東省農科院水稻研究所提供。所有試劑及引物均購自上海生物工程有限公司。

　　3.2 標記選擇

　　采用 NY/T1433-2014 附錄 C 中推薦的 48 對 SSR 引物，對雙親及雜交種子進行多態性篩選。選用在雙親中具有較好多態性的 SSR 引物(表 3)。

　　3.3 種子發芽

　　隨機選取超過 300 粒雜交水稻種子和 10 粒雙親種子，放入發芽盒，置于 30℃恒溫箱中發芽 5 d。

　　3.4 DNA 提取

　　(1)分別取水稻幼嫩葉片加入 2 mL 離心管，放入鋼珠，用研磨儀磨碎;(2)加入 650 μL 65 ℃預熱的 2% CTAB 提取緩沖液;(3) 65 ℃水浴 30 min，其間輕搖 2~3 次;(4)加入等體積氯仿;用力搖勻 1~2 min;(5) 10 000 r/min 離心 5 min，將上清液轉入一個新的 1.5 mL 的離心管中(步驟(4)~(5)可重復 1~2 次);(6)加入 2 倍體積-20 ℃預冷的無水乙醇，混勻，低溫放置 10 min;(7) 10 000 r/min 離心 3 min，棄上清;(8) 70%乙醇清洗，吹干;(9)將 DNA 溶于 ddH2O 中。

　　3.5 普通 PCR 擴增

　　反應體系(10 μL)：PCRmix (中科瑞泰生物技術有限公司) 5 μL，ddH2O 3 μL，DNA 模板 1 μL，正反向引物各 0.5 μL。反應程序：95 ℃預變性 5 min;95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30 個循環;72 ℃再延伸 5 min。PCR 反應產物采用 8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

　　3.6 多重 PCR 擴增

　　反應體系：在普通 PCR 的基礎上多加入 1~2 對的引物，其他成分和用量不變。反應程序與普通 PCR 相同。

　　3.7 純度的計算方法

　　純度的計算方法：樣品純度=(樣品總數-雜種數)/樣品總數*100%