白樺BpSPL6基因啟動子的克隆及表達分析

　　摘要:【目的】SPL 是植物特有的轉錄因子，參與植物幼年期向成年期的轉變、營養生長向生殖生長的轉變、花發育、孢子發生、葉片和根發育、逆境響應等多個過程，在植物的生長發育過程中起著非常重要的作用。探究白樺中 BpSPL6 基因啟動子區的順式作用元件，以及該啟動子在正常和脅迫條件下的表達模式，可為進一步研究 BpSPL6 基因的功能提供參考，也可為了解白樺的抗逆機制提供依據。【方法】以本實驗室組培白樺的總 DNA 為模板，經 PCR 克隆了 BpSPL6 基因上游 1 703 bp 的啟動子序列，用 PLACE 和 Plant CARE 在線軟件分析啟動子區的順式作用元件。構建了 BpSPL6 基因啟動子驅動 GUS 報告基因的植物表達載體并轉化擬南芥，探究其組織表達特性和脅迫條件下的表達模式。【結果】PCR 成功克隆了 BpSPL6 基因上游 1 703 bp 的啟動子序列，對啟動子區的順式作用元件預測發現除了含有核心啟動元件 TATA-box、 CAAT-box 外，還包括 2 種特異組織表達元件(根、花粉)，10 種激素響應元件(生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸)，4 種脫水響應元件等。對轉基因擬南芥進行 GUS 染色結果表明，BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在轉基因擬南芥中的表達具有時空特異性。在擬南芥的整個發育過程中，BpSPL6 基因啟動子驅動 GUS 基因在真葉葉片中表達，但是表達部位不同。隨著葉片的生長，首先在葉片的頂端表達，隨后擴展到葉片的葉脈并直至整個葉片，并且表達量逐漸升高。同時 BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在擬南芥營養生長時期的根部都有表達。并且經氯化鈉和甘露醇脅迫后其表達量降低。對比兩種脅迫，受到氯化鈉脅迫后 GUS 基因的表達量變化更大，說明對氯化鈉脅迫的響應更加強烈。【結論】BpSPL6 基因可能參與了植物的葉片、根發育以及對鹽和干旱脅迫的響應。

　　本文源自李豆; 蘇功博; 胡曉晴; 宋婷婷; 孫慶斌; 徐昭; 劉雪梅; 王宏偉， 北京林業大學學報 發表時間：2021-06-11

　　關鍵詞：白樺;SPL;啟動子;順式作用元件;GUS 染色;鹽脅迫;干旱脅迫

　　植物體內基因表達受到精密的調控，涉及到啟動子、終止子、UTR 序列等調控元件，其中啟動子序列具有主導作用[1]。高等植物基因表達主要由啟動子與轉錄因子之間的相互作用來調控，啟動子的應答序列決定了基因的特定表達[2] ，其表達模式可以反映相應基因的功能。

　　SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)基因編碼植物所特有的轉錄因子，最初從金魚草(Antirrhinum majus)中發現，因其具 SQUAMOSA 啟動子結合活性而得名[3] ，近年來陸續在其他植物中也發現了該類基因。SPL 基因都含有一個由 76 個氨基酸殘基組成的高度保守的 SBP 結構域，包括 2 個鋅指結構和 1 個核定位信號，以此結構域同下游靶基因啟動子區結合，調控靶基因的表達[4]。SPL 基因在植物的生長發育過程中起著非常重要的作用，研究發現 SPL 基因參與植物幼年期向成年期的轉變[5] 、營養生長向生殖生長的轉變[6−7] 、花發育[8−9] 、孢子發生[10] 、葉片和根發育[11−13] 、逆境響應[14−16] 等多個過程。最近的研究表明，SPL 基因是許多植物非生物脅迫耐受性的關鍵調節因子。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中 過 表 達 葡 萄 (Vitis pseudoreticulata)的 VpSBP16 基因，通過調節 SOS(salt overly sensitive)和 ROS(reactive oxygen species)信號通路，增強其對鹽和干旱脅迫的耐受性[17]。MsSPL8 表達量的下調導致轉基因苜蓿(Medicago sativa)的耐鹽性和耐旱性增強[18]。BpSPL9 通過提高對 ROS 的清除，使白樺(Betula platyphylla)對鹽和干旱脅迫具有耐受性[19]。

　　近年來已有多種高等植物轉錄因子的啟動子被克隆并進行功能分析。毛果楊(Populus trichocarpa) PTLF 基因啟動子可驅動 GUS 基因在楊樹葉脈、嫩枝頂端的擴展葉和葉原基中表達[20]。水稻(Oryza sativa)OsGEX2 基因啟動子是花粉特異性啟動子，順式作用元件分析發現其含有許多花粉特異性增強子元 件 LAT52/56 和 POLLEN1LE-LAT52[21]。 胡 楊(Populus euphratica)PeNAC1 基因啟動子的活性受赤霉素和非生物脅迫誘導[22]。菊花(Chrysanthemum dichrum)DREB 轉錄因子的啟動子 CdDREBa 受鹽脅迫誘導[23]。水稻抗旱相關基因 OsGRAS1 上游 1 332 bp 啟動子序列含有多個與干旱脅迫相關的調控元件，且其順式作用元件的缺失和增加可以直接影響內源基因的表達[24]。白樺 BpSPL8 基因啟動子區包含多種組織特異的啟動元件和脅迫響應元件，且過表達 BpSPL8 基因能夠降低擬南芥的耐旱性[25]。

　　白樺是我國東北地區的重要經濟樹種之一，其木材廣泛用于建筑和家具行業。非生物脅迫會對白樺的生長發育造成嚴重的影響，研究白樺的非生物脅迫響應機制具有重要意義。因此本文克隆了 BpSPL6 基因的啟動子，進行順式作用元件分析，并對其轉基因擬南芥在正常、鹽和干旱脅迫條件下的表達模式進行了分析，可為進一步研究 BpSPL6 基因的功能提供參考，也可為了解白樺的抗逆機制提供依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　用于提取基因組的白樺來自本實驗室的組培白樺幼苗，以哥倫比亞野生型擬南芥作為受體材料。

　　試驗試劑：植物表達載體 pBI121-GUS、大腸桿菌DH5α 和農桿菌EHA105 由本實驗室保存，pMD18-T 載體購于寶生物工程有限公司。高保真酶 KODplus-Neo 試劑盒購自 TOYOBO 公司。Taq 酶、DNA 提取試劑盒、膠回收劑盒和質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。T4 連接酶、限制性內切酶 HindⅢ和 BamHⅠ均購自 NEB 公司。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 白樺 BpSPL6 基因啟動子的克隆

　　利用 CTAB 法提取白樺的總 DNA。根據白樺基因組數據庫在 BpSPL6 基因上游 1 948 bp 處設計特異性引物。上游引物 BpSPL6-promoter1F：5′-ATGGGG ACCAAACACTTACTT-3′，下游引物 BpSPL6-promoter1R：5′-GCGAGTAAAGCTCTTTCACAA-3′。根據高保真酶 KOD-plus-Neo 試劑盒的反應體系，以白樺總 DNA 為模板，采用 3 步法的 PCR 程序，其中 56 ℃ 退火 30 s，68 ℃ 延伸 2 min，30 個循環，進行 PCR 擴增。膠回收目的片段，連入克隆載體 pMD18-T 并轉入大腸桿菌 DH5α 中，經菌液 PCR 鑒定，挑選陽性克隆送至吉林省庫美生物科技有限公司測序。

　　使用PLACE [26] 和Plant CARE [27] 在 線 軟件分析 BpSPL6 基因啟動子所含有的順式作用元件。

　　1.2.3 植物表達載體構建

　　根據 BpSPL6 基因啟動子序列設計酶切引物，F： 5 ′-GCAAGCTTATGGGGACCAAACACTTACTT-3 ′ (下劃線標記為 HindⅢ酶切位點)，R：5′-GCGGATCC GCGAGTAAAGCTCTTTCACAA-3′(下劃線標記為 BamHⅠ酶切位點)。以測序正確的克隆載體為模板，PCR 擴增帶有酶切位點的啟動子序列。將帶有酶切位點的啟動子序列與表達載體 pBI121-GUS 分別用 HindⅢ和 BamHⅠ限制性酶雙酶切，切膠回收后用 T4 連接酶連接并轉化大腸桿菌 DH5α，進行菌液 PCR 鑒定，挑選陽性克隆送至吉林省庫美生物科技有限公司測序。

　　1.2.4 擬南芥的遺傳轉化

　　將測序正確的表達載體轉化農桿菌 EHA105，進行菌液 PCR 鑒定，浸花法轉化擬南芥[28]。收取成熟的種子播種于添加卡那霉素的 MS 培養基中進行篩選，2 周后將抗性幼苗移栽入土壤中，提取葉片 DNA 進行 PCR 檢測，檢測成功的幼苗收集種子用于后續試驗。

　　1.2.5 白樺 BpSPL6 基因啟動子的表達模式分析

　　將轉 BpSPL6 基因啟動子的擬南芥種子播種于 MS 培養基中，放入 4 ℃ 冰箱春化 2 d 后，于光照培養箱中分別培養 7、10、25 d 獲得不同發育時期的擬南芥幼苗。將生長 14 d 的幼苗分別移植到 MS， MS+125 mmol/L 氯化鈉，MS+200 mmol/L 甘露醇培養基中培養 3 d，獲得正常條件下生長 17 d 的擬南芥和氯化鈉和甘露醇脅迫 3 d 后的擬南芥幼苗。將以上擬南芥幼苗整株浸泡在 GUS 染液中過夜染色(每種處理均染色 3 株幼苗)，第 2 天用 V乙醇∶V乙酸 = 3∶1 脫色液脫色，每隔 1 h 更換脫色液直到綠色完全褪去，用顯微鏡觀察 GUS 染色情況。

　　2 結果與分析

　　2.1 白樺 BpSPL6 基因啟動子的克隆

　　根據白樺基因組數據庫在 BpSPL6 基因上游 1 948 bp 處設計特異性引物。以白樺總 DNA 為模板，進行 PCR，電泳后得到一條 2 000 bp 左右的條帶(圖 1)。將此條帶進行切膠回收后與 pMD18-T 克隆載體連接 ，轉化大腸桿菌 ，進行測序。測序得到 1 703 bp 的序列，將測序結果分別與白樺和歐洲白樺(Betula pendula)基因組中 BpSPL6 基因啟動子序列進行比對(圖 2)，確定獲得了 BpSPL6 基因的啟動子。

　　2.2 白樺 BpSPL6 基因啟動子順式作用元件分析

　　使用 PLACE 和 Plant CARE 在線軟件對 BpSPL6 基因啟動子的順式作用元件進行預測(表 1，圖 3)。結果表明，BpSPL6 基因的啟動子區包括核心啟動元件 TATA-box、CAAT-box 和 4 種光響應元件(GT1- motif、Box 4、GA-motif、AT1-motif)，還包括多種激素響應元件，其中有 4 種生長素響應元件(AuxRRcore、TGA-element、CATATGGMSAUR 和 NTBBF1- ARROLB)，3 種赤霉素響應元件(GARE2OSREP1、 WRKY71OS、P-box)，1 種水楊酸響應元件(WBOXATNPR1)，2 種脫落酸響應元件(ABRE、DPBFCOREDCDC3)。另外發現 1 種花粉特異表達的順式作用元件(POLLEN1LELAT52)和 1 種與根相關的順式作用元件(ROOTMOTIFTAPOX1)。

　　值得注意的是，該啟動子區還包括 4 種脫水響應元件 ，其中包括 5 個 MYB1AT，12 個 MYCCONSENSUSAT，4 個ACGTATERD1 和1 個MYBCORE 元件;2 種傷害響應元件，其中包括 7 個 WBOXNTERF3 元件和 33 個 DOFCOREZM 元件;4 個熱激信號響應元件 CCAATBOX1。序列分析結果表明BpSPL6 基因很可能參與激素調節、花粉發育、根發育和干旱、鹽、熱脅迫等非生物脅迫的生物過程。

　　2.3 植物表達載體的構建

　　將測序正確的克隆載體和 pBI121-GUS 表達載體 用 雙 酶 切 的 方 法 構 建 植 物 表 達 載 體 ， 菌 液 PCR(圖 4)和測序鑒定均正確，說明表達載體構建成功，命名為 pBI121-BpSPL6 promoter::GUS。

　　2.4 擬南芥的遺傳轉化

　　將上一步構建好的植物表達載體轉化農桿菌 EHA105，經菌液 PCR 檢測成功后，采用浸花法轉化擬南芥。用 CTAB 法提取擬南芥整株幼苗的 DNA，用特異性引物進行 PCR 檢測(圖 5)，選用 4 號泳道的株系進行后續試驗。

　　2.5 白樺 BpSPL6 基因啟動子在擬南芥中的表達模式

　　為了探究白樺 BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在擬南芥中的表達模式，對不同發育時期的轉基 因 擬 南 芥 植 株 進 行 GUS 染 色 。 研 究 表 明 ， BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在擬南芥的不同發育時期表現出不同的表達模式。擬南芥植株春化后生長 7 d 以后，GUS 基因主要在根部(圖 6A，C)表達，在真葉頂端(圖 6A，B)也有微弱的表達。生長 10 d 后，GUS 基因在真葉葉片頂端(圖 6D，E)和下胚軸(圖 6D，F)有較高的表達量，同時在根(圖 6D， G)、真葉葉片葉脈(圖 6D，E)中也有表達，但是表達量較低。

　　當擬南芥植株生長 25 d 后，擬南芥已經進入生殖生長期，BpSPL6 啟動子驅動的 GUS 基因在蓮座葉的成熟葉片中表達量最高(圖 7A，B)，在莖生葉以及蓮座葉的幼嫩葉片的葉脈中有較低的表達(圖 7A， C)，靠近花朵最幼嫩的葉片的頂端有微弱的表達(圖 7D)，在擬南芥的花(圖 7D)、雌蕊(圖 7E)、雄蕊(圖 7E)、以及角果(圖 7F)及根部(圖 7A，G)中均未檢測到 GUS 基因的表達。

　　轉基因擬南芥生長 17 d 時，擬南芥仍處于營養生長期，BpSPL6 基因啟動子驅動 GUS 基因在整株擬南芥中都有較高的表達(圖 8A，B，C，D)，明顯高于生長 7 d(圖 6A，B，C)和 10 d(圖 6D，E，F)的表達量。

　　總之，在擬南芥的整個發育過程中，BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在真葉葉片中都有表達，但是表達部位不同。隨著葉片的生長，首先在葉片的頂端表達，隨后擴展到葉片的葉脈直至整個葉片，并且表達量逐漸升高。同時 BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在整個營養生長期的根部都有表達，但在生殖生長期只在擬南芥葉片的特定部位表達。

　　2.6 轉基因擬南芥在鹽和干旱脅迫下的表達模式

　　為了探究白樺 BpSPL6 基因在鹽、干旱脅迫中的作用，我們將正常生長 14 d 的轉基因擬南芥分別在正常條件和 125 mmol/L 氯化鈉、200 mmol/L 甘露醇脅迫下培養 3 d 后，進行 GUS 染色并拍照分析其表達模式。結果表明，遭受氯化鈉和甘露醇脅迫的轉基因擬南芥與未處理的相比，BpSPL6 啟動子驅動的 GUS 基因的表達量降低，在葉片(圖 8A，B，C)、根(圖 8A，D)下胚軸(圖 8A，E)中都有明顯的降低。兩種脅迫相比，受到氯化鈉脅迫后 GUS 表達量變化更大，說明 BpSPL6 基因啟動子對氯化鈉脅迫的響應更加強烈。總體而言，對轉基因擬南芥進行鹽、干旱脅迫處理后 BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因表達下調，說明該基因啟動子響應于氯化鈉和甘露醇脅迫，因此推測 BpSPL6基因可能在鹽和干旱脅迫中發揮一定的作用。

　　3 討　　論

　　SPL 基因編碼植物特有的轉錄因子，在植物葉片發育、時期轉變、花果發育、植物形態建成、赤霉素信號轉導、孢子發生和對銅和真菌毒素的反應等方面發揮重要作用[29]。本研究發現 BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在第 7、10、17 和 25 d 轉基因擬南芥的葉片中均有表達，且表達量逐漸上升，在生殖生長期的成熟葉片中表達量達到最高。擬南芥葉片的生長發育需要 8 個 SPL 基因的參與[29−30]。與白樺 BpSPL6 基因同源的苜蓿 SPL13 基因過表達會導致苜蓿葉片卷曲[31]。同樣擬南芥中 BpSPL6 的同源基因 AtSPL13 也 參 與 了 葉 片 的 發 育 [32]。 棉 花(Gossypium hirsutum)GhSPL3 和 GhSPL18 參與了葉片和第二芽的發育，且大多數 SPL 基因在葉片、莖和花中具有較高的轉錄水平[13]。說明 BpSPL6 基因很可能參與了葉片的發育。另外 SPL 基因與植物的階段轉變密切相關，在營養生長時期隨著植物的生長， SPL 基 因 的 表 達 量 逐 漸 上 升 [7,29]。 在 本 研 究 中 BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因符合此表達模式。本研究中并未在擬南芥成熟的花和角果中發現 GUS 基因的表達 。前期研究發現 AtSPL13 基因(BpSPL6 基因的同源基因)在擬南芥幼花和發育中的花中高表達，但在成熟的花和長角果中表達量極低[29]。至于 BpSPL6 基因是否參與了花的發育過程還需要進一步驗證。

　　近年來發現 SPL 基因參與了植物根的發育，擬南芥 SPL3、SPL9 和 SPL10 過表達會抑制側根生長，同時過表達 SPL9 會增加初生根的長度[12]。最新研究發現擬南芥 rSPL10(與 miR156 結合位點發生突變，不受 miR156 的調控)過表達增加提高了分生組織的活性和初生根的長度[33]。本試驗中 BpSPL6 基因啟動子驅動 GUS 基因在轉基因擬南芥營養生長期的根尖及根部其他部位表達，這與 AtSPL13 在根部的表達模式類似[32]。同時在營養生長時期其在根部的表達也隨植物的生長逐漸增加，與前人研究一致。而且啟動子區包含根發育相關的順式作用元件 ROOTMOTIFTAPOX1，因此推測 BpSPL6 基因可能在植物的根發育過程中起作用。但是在生殖生長期的根部并未檢測到其表達，具體原因需要進一步驗證。

　　BpSPL6 基因啟動子的順式作用元件分析表明，其啟動子區含有 10 種激素響應元件(生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸)。激素參與了植物生長發育的各個方面，已有多項研究表明 SPL 基因參與植物的激素響應過程。在擬南芥中 ，RNA-seq 研究發現 SPL10 對茉莉酸、水楊酸和生長素等激素響應有廣泛的影響。SPL10 通過調節生長素生物合成抑制根的再生[34]。AtSPL8 是植物發育過程中響應赤霉素信號的組織依賴性調節劑，參與赤霉素生物合成和信號傳遞的基因表達量受到 AtSPL8 影響[35]。另外赤霉素通過調節莖分生組織中的 AtSPL3、4、5 基因促進開花[36]。蘋果(Malus × domestica)在赤霉素脅迫后，大多數 MdSBP 基因顯著下調。經脫落酸脅迫后，MdSBP1 基因的表達量顯著上升，MdSBP8、21、 22 的表達量顯著降低[37]。因此推測 BpSPL6 基因參與了植物的激素響應過程。

　　白樺 BpSPL6 基因啟動子中還含有 4 種脫水響應元件(MYB1AT、MYCCONSENSUSAT、ACGTATERD1、MYBCORE)。已知鹽和干旱脅迫都會造成植物的脫水，因此我們推測 BpSPL6 基因啟動子參與鹽和干旱的響應過程。為了驗證這個設想，我們對 BpSPL6 基因啟動子轉基因擬南芥進行了氯化鈉和甘露醇脅迫試驗，發現脅迫后 BpSPL6 啟動子驅動的 GUS 基 因 表 達 量 降 低 。 有 研 究 表 明 與 白 樺 BpSPL6 基因同源的苜蓿 SPL13 基因參與苜蓿的干旱脅迫過程，抑制 SPL13 基因的表達會降低苜蓿的耐 旱 性 [31]。 在 玉 米 (Zea mays)中 ， 57%(11/19)的 miR156 靶向的 SPLs受到鹽或/和干旱的抑制[38]。擬南芥通過 miR156-SPLs-DFR 途徑適應環境，以協調發育和非生物脅迫的耐受性。當擬南芥受到氯化鈉和甘露醇脅迫后，SPL9、SPL10 基因的表達量顯著下降[39]。我們發現當 BpSPL6 基因啟動子轉基因擬南芥受到氯化鈉和干旱脅迫后，BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因表達量降低，這與前人對 SPL 基因在脅迫下表達模式的研究結果一致。這些結果表明 BpSPL6 基因很可能參與鹽和干旱脅迫響應過程。

　　4 結　　論

　　本文獲得了白樺 BpSPL6 基因上游 1 703 bp 的啟動子序列。對啟動子區的順式作用元件預測發現除了含有核心啟動元件外，還包括 2 種特異組織表達元件(根、花粉)，10 種激素響應元件(生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸)，4 種脫水響應元件等。GUS 染色結果表明，BpSPL6 基因啟動子驅動的 GUS 基因在轉基因擬南芥中的表達具有時空特異性。在擬南芥的整個發育過程中，BpSPL6 基因啟動子驅動 GUS 基因在真葉葉片中表達，但是表達部位不同。同時在營養生長時期的根部都有表達。對轉基因白樺分別進行氯化鈉和甘露醇脅迫發現，兩種脅迫后 GUS 基因的表達量降低，氯化鈉脅迫后響應更為強烈。結果表明，BpSPL6 基因可能參與了植物的葉片、根發育以及對鹽和干旱脅迫的響應。