水稻心白突變體xb1的淀粉理化特性分析

　　摘 要: 淀粉是稻米胚乳的主要成分，解析其理化特性對改良水稻品質(zhì)具有十分重要的意義。為了探究心白稻米淀粉的理化特性，本研究以經(jīng) EMS 誘導(dǎo)粳稻品種遼星 1 號獲得的心白突變體 xb1 為材料，利用掃描電鏡、激光粒度分析儀、RVA 快速黏度分析儀、差示掃描量熱儀等方法，對形態(tài)結(jié)構(gòu)、淀粉顆粒結(jié)構(gòu)和粒徑分布、糊化特性及熱力學(xué)特性等進行了分析。結(jié)果表明，與野生型相比，突變體 xb1 籽粒的粒寬、粒厚和千粒重均顯著降低; 淀粉結(jié)構(gòu)和淀粉粒粒徑分布均發(fā)生改變，淀粉粒粒徑值大于 13 左右的淀粉粒數(shù)量明顯低于野生型; 突變體種子中蛋白質(zhì)含量極顯著高于野生型，總淀粉含量極顯著低于野生型，而直鏈淀粉含量沒有明顯改變; 在支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)上，聚合度( DP) 在 6 ～ 9 之間的短鏈及 25 ～ 35 之間的中長鏈比例有所增加，而 DP 值在 10 ～ 24 之間的中短鏈及 36 ～ 50 之間的長鏈比例有所減少; 突變體 xb1 淀粉的糊化起始溫度( To) 、峰值溫度( Tp) 、終止溫度( Tc) 和糊化距離( Tr) 均未發(fā)生明顯改變，只有熱焓值( △H) 極顯著提高。同時，突變體 xb1 的 RVA 譜特征值中，熱漿黏度( HPV) 、峰值黏度 ( PKV) 、冷膠黏度( CPV) 和消減值( SBV) 極顯著提高，崩解值( BDV) 和回復(fù)值( CSV) 極顯著降低。本研究結(jié)果為探索堊白形成的生理機制以及進一步的基因克隆奠定了基礎(chǔ)。

　　呂軍; 姜秀英; 劉軍; 解文孝; 韓勇; 沈楓， 核農(nóng)學(xué)報 發(fā)表時間：2021-08-05

　　關(guān)鍵詞: 水稻; 心白突變體; 淀粉; 理化特性

　　隨著生活水平的日益提高，人們對稻米品質(zhì)尤其是食味品質(zhì)有了更高的要求。淀粉是稻米胚乳的主要成分，其組成、結(jié)構(gòu)和理化特性決定了稻米的外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)[1-3]。因此，深入研究水稻淀粉特性，對改良水稻品質(zhì)具有十分重要的意義。

　　堊白是由于籽粒灌漿不充分，胚乳中的淀粉和蛋白顆粒排列疏松，相互間存在的空隙影響了光的透射而形成的白色不透明部分。根據(jù)其在胚乳上的不同位置可分為腹白、背白和心白等多種類型[4-6]。胚乳淀粉排列不緊密，導(dǎo)致米粒在加工過程中易斷裂，整精米率降低，蒸煮后米粒斷裂，影響食味品質(zhì)[7-8]。

　　長期以來，已利用自然突變和人工誘變獲得了大量胚乳淀粉突變體材料，如堊白突變體、高直鏈淀粉突變體、糯性突變體、粉質(zhì)突變體、糖質(zhì)突變體、暗色突變體、皺縮突變體等[9-12]，其中已報道的堊白突變體有 gpa1、 osbt1、ospk2、flo4、flo5 等。并對這些突變體開展了淀粉合成相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)這些突變體的淀粉特性均發(fā)生了一定的變化，如直鏈淀粉含量、淀粉粘滯特性、熱力學(xué)特性、支鏈淀粉鏈長分布等。進一步通過基因克隆及功能研究，逐步明確了其在淀粉合成及調(diào)控中的作用。

　　Wang 等[13]發(fā)現(xiàn)突變體 gpa1 呈現(xiàn)白心胚乳，胚乳中復(fù)合淀粉顆粒呈圓形且包裹松散，該 突 變 基 因 OsRab5a 位 于 第 12 染 色 體，編 碼 一 個 GTP 酶 ( GTPase) ，參與胚乳細(xì)胞液泡中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因 GIF1，位于第 4 染色體，參與籽粒灌漿早期的碳源分配，該基因突變后產(chǎn)生心白，粒重、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量降低。Li 等[14]發(fā)現(xiàn)突變體 osbt1 呈現(xiàn)心白表型，總淀粉和直鏈淀粉含量降低，支鏈淀粉中短鏈增加，中長鏈減少，復(fù)合淀粉顆粒發(fā)育不正常，該突變基因 OsBT1 編碼 ADPG 轉(zhuǎn)運蛋白，在水稻種子發(fā)育過程中參與調(diào)控淀粉合成和復(fù)合淀粉顆粒的形成。Cai 等[15]發(fā)現(xiàn)突變體 ospk2 呈現(xiàn)心白表型，總淀粉和直鏈淀粉含量顯著下降，蛋白和脂肪含量增加，支鏈淀粉中中短鏈比例降低，中長鏈增多，該突變基因 OsPK2 編碼一種質(zhì)體丙酮酸激酶 ( pyruvate kinase PK) ，在淀粉合成、復(fù)合顆粒形成和籽粒灌漿過程中起重要作用。Flo4 是一個 T-DNA 插入突變體，胚乳呈現(xiàn)心白表型，粒重下降，蛋白質(zhì)含量和脂肪含量增加，該突變基因 OsPPDKB 編碼丙酮酸磷酸雙激酶，在水稻胚乳淀粉代謝和結(jié)構(gòu)中起重要作用[16]。flo5 突變體籽粒呈現(xiàn)心白表型，粒重減小，支鏈淀粉的長鏈[聚合度 ( degree of polymerization，DP) ≥30]顯著減少，快速黏度分析儀( rapid viscosity analyzer，RVA) 譜發(fā)生顯著變化，突變基因 SSIIIa 編碼淀粉合成酶，主要參與支鏈淀粉 B2-B4 鏈的延伸[17-18]。SSIIa 和 SSIIIa 雙突變植株中，胚乳支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，短鏈和長鏈減少，中長鏈含量增加，雙突植株表現(xiàn)出明顯的堊白表型[19]。近幾年，一系列水稻 flo 突變體被鑒定，包括 flo12、flo14、flo15、flo16 等[20-24]，這些突變體的突變基因有些還未被克隆，有些雖已被克隆，但調(diào)控的分子機理尚不清晰。水稻胚乳淀粉的合成與調(diào)控是非常復(fù)雜又精細(xì)的過程，因此還需要挖掘更多胚乳淀粉突變體，進一步解析淀粉的生物合成途徑與調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)，為稻米品質(zhì)改良提供堅實的理論基礎(chǔ)。

　　本研究以經(jīng)甲基磺酸乙酯 ( ethyl methane sulfonate，EMS) 誘導(dǎo)粳稻品種遼星 1 號獲得的心白突變體 xb1 為材料，對其表型特征及淀粉理化特性進行了分析，旨在了解心白突變的形成機制，為進一步的突變基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1. 1 突變體材料

　　遼星 1 號經(jīng) EMS 誘變處理，在其后代對胚乳堊白性狀進行篩選，從中發(fā)現(xiàn)一個能夠穩(wěn)定遺傳的、表型明顯的心白突變體，命名為 xb1。野生型遼星 1 號和突變體 xb1 種植于遼寧省水稻研究所試驗地，成熟期收獲籽粒，自然晾干，并在室溫下保存。

　　1. 2 突變體表型特征

　　利用 Laser Jet M1136 掃描儀( 惠普中國) 對野生型和突變體 xb1 的籽粒、糙米和糙米橫截面進行拍照。利用游標(biāo)卡尺測量 10 粒種子的粒長、粒寬和粒厚，求平均值，重復(fù) 3 次。隨機選取 1 000 粒種子稱重，求平均值，重復(fù) 3 次。

　　1. 3 淀粉粒結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

　　分別選取野生型和突變體 xb1 的完整精米樣品，用刀片將米粒橫向切開，使橫斷面向上，利用真空鍍膜儀對橫斷面鍍金后，在 JSM-7500F 掃描電鏡( 日本電子) 上觀察和拍照。

　　1. 4 淀粉粒的粒徑分布

　　淀粉提取: 將精米用 3 倍體積的亞硫酸鈉水溶液浸泡，精米充分吸收膨脹后，轉(zhuǎn)移至勻漿機中勻漿粉碎，隨后將勻漿液轉(zhuǎn)移至 200 目篩網(wǎng)中過濾，并用亞硫酸鈉水溶液充分清洗濾渣，收集濾液，靜置過夜，倒掉上清液，用新的亞硫酸鈉溶液清洗，重復(fù) 5 ～ 8 次，待淀粉呈白色，上清液透明時，徹底倒掉上清液，將淀粉自然晾干，轉(zhuǎn)移至恒溫箱中水分平衡 1 周，研缽研磨分散，過 200 目樣品篩。

　　取 100 mg 淀粉于干凈 EP 管中，加入 1 mL 75%酒精，渦旋混勻后超聲混勻，利用 Matersizer 3000 激光粒度分析儀( Malvern Instruments Ltd，Worcestershire，英國) 進行粒度分布測定，重復(fù)測定 3 次。

　　1. 5 總淀粉、直鏈淀粉和蛋白質(zhì)含量測定

　　總淀粉含量測定: 稱取 100 mg 淀粉于 15 mL 試管中，加入 4 mL 80%乙醇，70℃放置 2 h，期間漩渦混勻。 12 000 r·min-1 離心 10 min，加 4 mL 80%乙醇，重復(fù)清洗 3 次。小心倒出上清，加入 0. 2 mL 80%乙醇，渦旋混勻，再加入 3 mL 耐熱 α-淀粉酶，沸水浴孵育 6 min，期間間斷渦旋混勻。將試管放置于 50℃ 的水浴鍋中，然后加入 0. 1 mL 淀粉葡糖苷酶，渦旋混勻，50℃ 孵育 30 min。用蒸餾水調(diào)節(jié)體積。取 0. 1 mL 至新的試管中，加入 3 mL GOPOG 試劑，渦旋混勻，于 50℃孵育 20 min，用 1510-04201 多功能酶標(biāo)儀( 美國賽默飛公司) 于 510 nm 波長下測定吸光度值。

　　直鏈淀粉含量測定: 稱取 10 mg 淀粉于 EP 管中，加入 100 μL 乙醇，900 μL NaOH 溶液，渦旋混勻。沸水煮 10 min，待冷卻后定容至 10 mL。取 0. 5 mL 上清于離心管中，加入 0. 1 mL 乙酸，0. 2 mL 碘化鉀溶液，定容至 10 mL，室溫放置 10 min 顯色，用 1510-04201 型多功能酶標(biāo)儀于 620 nm 處測定吸光度值。

　　蛋 白 質(zhì) 含 量 測 定: 采用凱氏定氮法，利 用 KJELTEC2300 凱氏定氮儀( 丹麥 FOSS 公司) 測定野生型和突變體的蛋白質(zhì)含量，重復(fù) 3 次，取平均值。

　　1. 6 支鏈淀粉鏈長分布

　　取已純化淀粉 5 mg，重懸于 5 mL 雙蒸水中，沸水浴 60 min，間斷渦旋混勻。取 2. 5 mL 的糊化樣品，加入 125 μL 醋酸鈉，5 μL 三氮化鈉和 5 μL 異淀粉酶， 38℃放置 24 h。加入 395 μL 硼氫化鈉，室溫放置 24 h。取 600 μL 于離心管中，室溫氮吹干燥。溶于 600 μL 流動相中，12 000 r·min-1 離心 5 min，取上清，用ICS5000 離子色譜系統(tǒng)進行檢測，采用電化學(xué)檢測器及 DionexTM CarboPacTM PA200( 3. 0 mm×250 mm) 離子色譜柱。流 動 相 A ( 100% 水 溶 液) ，流 動 相 B ( 100 mmol·L-1 NaOH、1 mol·L-1 NaAC) ，流 動 相 C ( 100 mmol·L-1 NaOH) ，流速為 0. 4 mL·min-1 ，柱溫為 30℃。每個樣品重復(fù)測定 3 次，取平均值。

　　1. 7 淀粉的粘滯特性

　　采用 3D 型 RVA 快速黏度分析儀 ( 澳 大 利 亞 Newport Scientific 公司) 測定。儀器自動讀出的一級參數(shù)有: 熱漿黏度( hot paste viscosity，HPV) 、峰值黏度 ( peak paste viscosity，PKV) 、冷 膠 黏 度 ( cool paste viscosity，CPV) 、糊化溫度( pasting temperature，PaT) ，二級參數(shù)有: 崩解值( breakdown viscosity，BDV = PKVHPV) 、消減值( setback viscosity，SBV = CPV-PKV) 、回復(fù)值( consistency viscosity，CSV = CPV-HPV) 。每個樣品重復(fù)測定 3 次，取平均值。

　　1. 8 淀粉的熱力學(xué)特性

　　采用 200-F3 差示掃描量熱儀( differential scanning calorimetry，DSC，德國 Netzsch 公司) 測量淀粉的熱力學(xué)特性。稱取 5 mg 米粉于鋁盤中，加入 10 μL 超純水，密封 2 h。升溫速率為 10℃·min-1 ，溫度范圍為 20 ～ 120℃。測定后根據(jù)測定曲線的吸熱峰邊界和面積，分析得到糊化起始溫度( onset temperature，To) 、峰值溫度 ( peak temperature，Tp ) 、終 止 溫 度 ( conclusion temperature，Tc) 熱焓值( enthalpy of gelatinization，△H) 和糊化距離( gelatinization range，Tr = Tc-To) 。每個樣品重復(fù)測定 3 次，取平均值。

　　2 結(jié)果與分析

　　2. 1 突變體的表型特征

　　突變體 xb1 是粳稻品種遼星 1 號經(jīng) EMS 誘變后篩選得到的能穩(wěn)定遺傳的胚乳堊白突變體，其種子表型與野生型( WT) 相似( 圖 1-A) ，而突變體 xb1 的糙米較野生型相比，中心呈現(xiàn)白色粉質(zhì)不透明，邊緣一圈呈現(xiàn)透明，即心白表型( 圖 1-B、C) 。在籽粒表型性狀上，突變體 xb1 種子的粒長與野生型無顯著差異( 圖 1- D) ，但粒厚顯著低于野生型( 圖 2-F) ，粒寬和千粒重極顯著降低( 圖 1-E、G) 。

　　2. 2 突變體的淀粉粒結(jié)構(gòu)和淀粉粒徑分布

　　利用掃描電鏡對野生型和突變體 xb1 糙米的橫切面進行觀察，野生型胚乳中的淀粉顆粒大小均一，排列較緊密，相互嵌合擠在一起呈現(xiàn)規(guī)則的多面體結(jié)構(gòu) ( 圖 2-A、B、C) ，而突變體 xb1 糙米的不透明部位胚乳中的淀粉顆粒大小不一，排列比較疏松，顆粒與顆粒之間存在較大的間隙，形成卵圓形或正圓形( 圖 2-D、E、 F) ，說明突變體 xb1 的淀粉合成過程中出現(xiàn)了異常，導(dǎo)致淀粉結(jié)構(gòu)的改變。

　　利用激光粒度分析儀對淀粉粒的粒徑值和粒徑分布進行測定，結(jié)果顯示( 圖 3) ，突變體 xb1 與野生型的淀粉粒大小分布相似，均呈單峰分布，但其分布曲線的峰值明顯高于野生型，且淀粉顆粒的大小分布范圍也相對集中。突變體 xb1 的平均粒徑( 11. 05 μm) 略小于野生型的平均粒徑( 11. 57 μm) ，但淀粉粒粒徑值大于 13 左右的淀粉粒數(shù)量明顯低于野生型。說明淀粉顆粒的粒徑分布受到心白突變的影響。

　　2. 3 突變體的種子成分分析

　　對突變體和野生型種子成分分析結(jié)果顯示( 圖 4) ，突變體的蛋白質(zhì)含量極顯著升高，野生型種子的蛋白質(zhì)含量為 8. 8%，突變體升高至 11. 2%。突變體的總淀粉含量極顯著減少，由 81. 5%減少到 78. 2%，而直鏈淀粉含量無顯著變化，說明該突變并未影響到直鏈淀粉的合成，而與蛋白質(zhì)和淀粉中支鏈淀粉的積累存在密切的聯(lián)系。

　　2. 4 突變體的支鏈淀粉鏈長分布

　　為進一步分析突變體中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)，對突變體 xb1 和野生型的支鏈淀粉的鏈長分布進行測定，結(jié)果表明，突變體種子的支鏈淀粉鏈長分布發(fā)生了明顯變化( 圖 5) ，與野生型相比，突變體 xb1 的聚合度( DP) 在 6 ～ 9 之間的短鏈及 25 ～ 35 之間的中長鏈比例有所增加，而 DP 值在 10 ～ 24 之間的中短鏈及 36 ～ 50 之間的長鏈比例有所減少，說明突變體 xb1 中支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

　　2. 5 突變體淀粉的熱力學(xué)特性

　　由表 1 和圖 6 可知，突變體 xb1 的峰值溫度( Tp) 與野生型相近，起始溫度( To) 和糊化距離( Tr) 均略高于野生型，但差異不顯著，而終止溫度( Tc) 顯著高于野生型，熱焓值( △H) 極顯著高于野生型。表明該突變不會對糊化溫度產(chǎn)生太大影響，但會造成熱能值顯著提高。

　　2. 6 突變體淀粉的粘滯特性

　　利用快速黏度分析儀 RVA 對突變體與野生型的黏度特性進行了測定，結(jié)果顯示，兩者的淀粉黏度存在明顯差異( 表 2 和圖 7) 。從 RVA 譜特征值看，突變體 xb1 除了糊化溫度與野生型相近外，其他參數(shù)均發(fā)生了極顯著的變化，突變體 xb1 的熱漿黏度( HPV) 、峰值黏度 ( PKV) 、冷膠黏度( CPV) 和消減值( SBV) 分別較野生型升高了 55. 9%、27. 0%、33. 1%和 111. 7%。崩解值( BDV) 和回復(fù)值( CSV) 分別較野生型降低了 34. 6%和 5. 8%。

　　3 討論

　　堊白不僅影響稻米的外觀品質(zhì)，而且影響稻米的加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)，因而直接決定了稻米的市場價格和受歡迎程度[25-26]。而堊白的形成機制較為復(fù)雜，與水稻植株內(nèi)“源庫流”的協(xié)調(diào)、籽粒灌漿動態(tài)及胚乳內(nèi)淀粉的形成和積累密切相關(guān)，同時還易受環(huán)境條件的影響，因此，堊白性狀的研究是當(dāng)前水稻品質(zhì)研究的熱點和難點[27-31]。本研究篩選到一個穩(wěn)定遺傳的心白突變體 xb1，其籽粒的粒長未發(fā)生明顯改變，但粒寬、粒厚和粒重顯著低于野生型。電鏡掃描結(jié)果顯示突變體 xb1 的淀粉顆粒大小不一，排列比較疏松，呈現(xiàn)卵圓形或正圓形。激光粒度儀測定結(jié)果顯示突變體 xb1 的淀粉顆粒的粒徑分布發(fā)生了改變。說明突變體 xb1 的淀粉合成過程發(fā)生了異常，導(dǎo)致淀粉粒結(jié)構(gòu)和分布發(fā)生改變。

　　淀粉是胚乳的主要成分，由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩部分組成。本研究結(jié)果表明，突變體 xb1 在直鏈淀粉含量沒有發(fā)生明顯變化的前提下，總淀粉含量極顯著降低，說明淀粉中支鏈淀粉含量極顯著減少。同時支鏈淀粉的鏈長分布也發(fā)生了顯著變化，相較于野生型，突變體 xb1 的聚合度( DP) 在 6 ～ 9 之間的短鏈及25 ～ 35 之間的中長鏈比例增加，而 DP 值在 10 ～ 24 之間的中短鏈及 36 ～ 50 之間的長鏈比例減少。前人研究表明，支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是決定淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及其功能特性的關(guān)鍵，也是造成直鏈淀粉含量相近的水稻品種間蒸煮食味品質(zhì)差異的主要原因[32-33]。支鏈淀粉的生物合成較為復(fù)雜，主要由可溶性淀粉合成酶( SSS) ，淀粉分支酶( SBE) 和淀粉脫支酶( DBE) 共同催化合成。Satoh 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，突變體 sbe1 的種子具有正常的表型，但中鏈( DP12 ～ 21) 和長鏈( DP > 37) 減少，而短鏈( DP < 10) 和中長鏈( DP24 ～ 34) 有所增加。本研究中突變體 xb1 的支鏈淀粉鏈長的變化特點，與突變體 sbe1 的變異特點一致，但突變體 xb1 是否含有 sbe1 的等位基因突變型，尚需要進一步驗證。

　　淀粉結(jié)構(gòu)的改變會導(dǎo)致相應(yīng)的理化指標(biāo)的改變。目前關(guān)于稻米淀粉結(jié)構(gòu)與淀粉理化特性的關(guān)系，不同研究者的研究結(jié)論不盡相同。Vandeputte 等[35]認(rèn)為DP6 ～ 9 的短鏈相對數(shù)量與稻米淀粉的糊化起始溫度 ( To) 、最高溫度( Tp) 、終結(jié)溫度( Tc) 及起始成糊溫度 ( pasting temperature，PT) 呈負(fù)相關(guān)，而 DP12 ～ 22 鏈長呈現(xiàn)相反結(jié)果。賀曉鵬等[36]研究指出，支鏈淀粉不同鏈長范圍的支鏈數(shù)量比例主要與淀粉的糊化溫度相關(guān)，而與淀粉的膠稠度和 RVA 特征值關(guān)系不密切。而突變體 xb1 淀粉的糊化起始溫度 ( To ) 、峰 值 溫 度 ( Tp) 、終止溫度( Tc) 和糊化距離( Tr) 均未發(fā)生明顯改變，這與 RVA 譜參數(shù)中的糊化溫度較野生型沒有明顯差異的結(jié)論一致。這一結(jié)果可能是直鏈淀粉含量未發(fā)生改變導(dǎo)致的，即突變體 xb1 淀粉的糊化特性與直鏈淀粉含量關(guān)系較為密切。與此同時，突變體 xb1 的RVA 譜特征值均發(fā)生了顯著改變，DP6 ～ 9、DP25 ～ 35 的增加和 DP10 ～ 24、DP36 ～ 50 的減少，使熱漿黏度 ( HPV) 、峰值黏度( PKV) 、冷膠黏度( CPV) 和消減值 ( SBV) 極顯著提高，崩解值( BDV) 和回復(fù)值( CSV) 極顯著降低。

　　4 結(jié)論

　　水稻心白突變體 xb1 的直鏈淀粉含量相對野生型未有明顯改變，其糊化溫度也沒有明顯差異，進一步證實淀粉的糊化特性與直鏈淀粉含量密切相關(guān)。突變體 xb1 的支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)中，DP6 ～ 9( 短鏈) 、DP25 ～ 35 ( 中長鏈) 的增加和 DP10 ～ 24( 中短鏈) 、DP36 ～ 50( 長鏈) 的減少，使 RVA 譜特征值均發(fā)生顯著改變，說明淀粉的粘滯特性受支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)的影響。本研究通過分析心白突變體 xb1 的淀粉理化性質(zhì)，有助于更深入了解淀粉合成、堊白發(fā)生機理，為進一步克隆該突變基因及稻米品質(zhì)改良奠定堅實基礎(chǔ)。