中國東海微型鞭毛蟲群落的分布特征及其環境影響因子

　　摘要：海洋微型鞭毛蟲 (Microbial flagellates) 是海洋原生生物中一類高度異質化的類群，物種多樣性高，具有多種營養方式，在全球海洋生態系統中占據廣闊的生態位，在生物地球化學循環中發揮著關鍵作用。 然而關于其生物多樣性和群落結構的認識十分有限，特別是有關環境因子與其生物地理分布關系的研究更為罕見。 為了探究微型鞭毛蟲群落多樣性、群落結構以及影響其生物地理分布格局的環境因素，本研究將高通量測序技術與傳統的顯微鏡觀測方法相結合，全面調查了中國東海春季和秋季微型鞭毛蟲的群落特征，并深入探討了與環境因子之間的關系。 結果表明：東海微型鞭毛蟲的豐度平均為 2.27×103個/ mL，表現為近岸處較高、隨離岸距離的增加而下降的趨勢;Shannon 多樣性指數呈現表層低于底層、近岸區低于陸架區的特征，反映了生物群落的穩定程度以及對環境條件的適應程度;不同類群的鞭毛蟲具有各自獨特的營養模式和相對固定的粒級，表現出對溫度、鹽度、溶解氧等環境因素的不同響應，從而使群落的物種組成和分布模式呈現明顯的季節變化和生境差異。 研究結果可為深入認識東海海洋微型鞭毛蟲的群落結構、分布格局以及環境影響因素提供理論依據。

　　關鍵詞：微型鞭毛蟲;高通量測序;群落結構;環境因子;東海

　　郭馨; 黃成; 林曉晴; 鄭欣怡; 劉強; 黃凌風， 生態學報 發表時間：2021-11-26

　　正如海洋中的經典食物鏈一樣，海洋微型生物食物網在維持海洋生態系統的結構和功能中同樣起到重要作用[1?2]。 其中，粒徑小于 20 μm 的微型鞭毛蟲(Microbial flagellates)以其龐大的多樣性、多樣的營養模式和快速的生長代謝率，成為微食物網中非常重要的一環，在全球海洋生態系統中占據廣闊的生態位，在生物地球化學循環中發揮著關鍵作用，是海洋生態學領域研究的焦點[3?4]。 鞭毛蟲不是分類學上的定義，而是包括具有相似生態學特征———具有一條或多條鞭毛，利用鞭毛進行運動或攝食活動的單細胞原生生物的群體總和[3， 5]。近年來，飛速發展和不斷更替的分子生物學技術揭示了海洋微型鞭毛蟲不可思議的龐大的多樣性，遠遠超過傳統方法(如分離培養和顯微鏡鑒定)所認知的數量[6]。 然而，大多研究并沒有將鞭毛蟲這一大類群單獨從原生生物或者微型真核生物中提取出來，而是將其與其他類群如纖毛蟲等作為一個整體群落進行分析[7]。 研究表明，大部分纖毛蟲種類的粒徑大于 20 μm，只有少數種類的粒徑在 20 μm 以內，是微型鞭毛蟲的主要捕食者[1]，在生態功能上與鞭毛蟲類群有著一定的區別。 因此，將鞭毛蟲類群與原生生物其他類群區分開來進行分析是非常有必要的。 目前，對海洋鞭毛蟲群落的研究已逐漸從有關其形態特征(具有鞭毛)或者營養模式(自養、異養和兼養)等結構和功能上的“同質性”向其在系統進化上的高度“異質性”進行轉變。 這種變化對于理解和認識該類群生物在現代(和未來)生態系統中獨特的生態地位、生態學過程、生物地理格局、在生態系統中的功能以及適應自然海區環境變化的響應機制等具有至關重要的意義[6， 8]，有助于促進對海洋鞭毛蟲的生態學研究從現象和作用(是什么?)向過程與機制(為什么?)不斷深入。東海是一個具有傾斜地形特征、陸架開闊的邊緣海[9]，受海陸分布以及冷、暖空氣交替的影響，具有明顯的季風性氣候特征[10?11]。 同時，復雜的季節性變化的水團運動影響著該海區的水文條件和生態環境[9， 11]，也影響了海洋微型鞭毛蟲群落的分布格局。 但是到目前為止，針對該海區微型鞭毛蟲群落結構及其與環境因子的相關性研究仍不多見。 本研究采用高通量測序結合傳統的顯微鏡觀測方法調查了東海微型鞭毛蟲的豐度、多樣性等群落特征，并分析了影響微型鞭毛蟲群落結構的關鍵環境因子，為揭示東海海洋微型鞭毛蟲的群落結構、分布格局以及環境影響因素提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 采樣時間和地點

　　本研究依托于國家自然科學基金委 2019 年春季(5 月)和秋季(9 月)的兩個“東海科學考察”共享調查航次，搭載“向陽紅 18”科學考察船開展了該海域環境因子和微型鞭毛蟲群落的調查。 每個站位選擇表層(海面下 3 m)和底層(距海底 5—10 m)兩個水層進行采樣。 兩個航次的調查站點見圖 1，使用 Surfer 20 作圖，注意春秋兩季相同名稱的采樣站點位置不一定相同。 為了分析的方便，根據地形將 50 m 等深線以內海域定義為近岸區，50—200 m 等深線之間的海域定義為陸架區。

　　1.2 環境因子的采集與測定

　　用 Niskin 采水器分別采集各層海水。 溫度(Temperature， Temp)、鹽度( Salinity， Sal)、溶解氧(Dissolvedoxygen， DO)數據用船載 CTD(SBE917plus， SeaBird Corp.， USA)現場測得。 營養鹽的測定包括硝態氮(NO3 ? N)、亞硝態氮(NO2 ?N)、氨氮(NH4 ?N)、活性磷酸鹽(PO4 ?P)和活性硅酸鹽(SiO3 ?Si)，各參數的檢測均依據國家《海洋調查規范—第 4 部分：海水化學要素調查》(GB / T12763.4—2007)方法進行[12]。 葉綠素 a(Chlorophylla， Chl a)濃度的測定采用丙酮萃取熒光法[13]。 超微型浮游生物包括海洋異養細菌(Heterotrophic bacteria，HB)、藍細菌(Cyanobacteria， Cyan)(包括聚球藻(Synechococcus， Syn)和原綠球藻(Prochlorococcus， Pro))和微微型真核生物(Pico?sized eukaryotes， pico?Euk)，其豐度采用流式細胞儀進行測定[14]，具體方法參考《海洋微型生物生態學》第 14 章《海洋微型生物流式圖像技術》的內容[15]。 小型浮游動物(Micro?zooplankon， micro? Zoo)(主要包括纖毛蟲、腰鞭毛蟲等)使用虹吸法進行富集后[16] 用 FlowCam 流式影像儀代替傳統顯微鏡鏡檢方法測定其豐度，再通過 VisualSpreadsheet 軟件對目標生物顆級(粒徑 20—100 μm)進行計數[17]。 以上生物因子的測定方法同時參考了《海洋調查規范—第 6 部分：海洋生物調查》(GB / T12763.6—2007)的內容[12]。

　　1.3 微型鞭毛蟲群落樣本的采集與處理

　　1.3.1 豐度樣本

　　微型鞭毛蟲(Nanoflagellate， NF) 的豐度測定以及營養結構和粒級結構的劃分方式參考了 Huang[13] 和Granda[18]等人的研究。 海水樣本經 20 μm 篩絹預過濾之后，依次進行固定、過濾、染色、制片等步驟。 玻片在熒光顯微鏡(Leica FW 4000)100 倍物鏡下鏡檢;在紫外激發光下，微型鞭毛蟲的細胞核顯藍光，以此確定細胞的存在;之后轉到藍色激發光下，觀察細胞是否呈現紅色熒光，有紅色熒光的為含色素體微型鞭毛蟲(Pigmented nanoflagellate， PNF)，包括自養型和兼養型微型鞭毛蟲，沒有紅色熒光的則為異養微型鞭毛蟲(Heterotrophic nanoflagellate， HNF);統計 HNF 和 PNF 在三個粒級(2—5、5—10、10—20 μm)內的個數。 微型鞭毛蟲的豐度(個/ mL)= (每個視野 NF 數量平均值×黑膜有效過濾面積) / 每個視野的面積×過濾水樣體積)。微型鞭毛蟲豐度的海區平面分布圖由 Ocean Data View(version 5.2.1)制作。

　　1.3.2 多樣性樣本

　　每個站位各水層采集 5 L 海水，先經 20 μm 篩絹預過濾后，依次通過直徑為 47 mm 的 2 μm 和 0.8 μm 孔徑的聚碳酸酯核孔膜(Millipore Corp.， Germany)，得到 0.8—2 μm、2—20 μm 粒級 的微微型和微型浮游生物樣本。 于液氮中保存，回到實驗室后于-20℃儲存。采用 Qiagen 公司的 PowerWater