中國南海矮小短指軟珊瑚(Sinularia nanolobata)的化學成分研究

　　摘要：運用硅膠柱色譜，凝膠柱色譜和高效液相色譜等分離技術，對中國南海西瑁島矮小短指軟珊瑚的丙酮提取物中的化學成分進行了系統研究，從中分離得到 10 個化合物. 采用多種波譜技術確定了這些化合物的化學結構. 分別鑒定為：羅伯塔特(1)、(1 7R)-loba-8,10,13(15)-triene-17,18-diol(2)、α-生育醌(3)、(1E,3Z,7E,11R,12R)-11-羥基-12-甲氧基-1-異丙基-4,8,12-三甲基-環十四碳1,3,7-三烯(4)、(+)-(1E,3E,7E,11R,12S)-11,12-epoxy-11,12-dihydrocembrene-C(5)、(1E,3E,7R,8S,11E)-7,8-環氧-1-異丙基-4,8,12-三甲基-環十四碳-1,3,11-三烯(6)、24-亞甲基-膽固醇(7)、孕烯醇酮(8)、3β,6α,11-三羥基-24-亞甲基-9,11-斷-5α-膽甾-7-烯-9-酮(9), Sinu grandisterol A(10). 其中化合物 1 為新的異戊烯基欖烷型二萜化合物. 生物活性實驗結果表明，化合物 3 對蛋白酪氨酸磷酸酶 1B (PTP1B) 的酶活力具有較好的抑制活性，其 IC50 為 4.83±2.35 μΜ，提示該化合物在治療糖尿病和肥胖癥的藥物開發中具有一定的潛力.

　　關鍵詞：中國南海;矮小短指軟珊瑚;異戊烯基欖烷型二萜;PTP1B 抑制活性

　　曾子溶;張夢夢;王鴻;李佳;郭躍偉有機化學2021-11-19

　　短指軟珊瑚(Sinularia 屬)的動物屬于于腔腸動物門珊瑚蟲綱八放珊瑚亞綱軟珊瑚目，主要分布于東非到太平洋的廣闊海域[1]，富含結構新穎和生物活性多樣的萜類和甾體化合物，是海洋天然產物的重要來源. 隨著分離分析技術的發展，從 Sinularia 中發現的化合物的種類也在不斷增加. 其中很多活性顯著的化合物可能成為藥物開發的先導化合物[2-4] . 最近有報道稱異戊烯基欖烷型二萜具有較好的抗炎活性[5]，然而該類化合物在海洋軟珊瑚中尚未得到充分的發掘. 因此，深入研究 Sinularia 中的異戊烯基欖烷型二萜類化學成分具有重要的研究價值. 本課題組長期致力于海洋生物活性物質的研究，已經從多種屬的短指軟珊瑚中發現了大量的活性天然產物，尤其是萜類和甾體類化合物. 前期工作中，本課題組從采自中國南海的多型短指軟珊瑚(S. polydactyla)中發現了三個新的異戊烯基欖烷型二萜[6] . 為了進一步探究該類化合物，豐富其種類和數量，以尋求結構新穎且具有較好生物活性的化合物，本文對采自中國南海西瑁島海域的矮小短指軟珊瑚(S. nanolobata)進行了化學成分研究. 從 S. nanolobata 的丙酮提取物中分離得到了 10 個化合物(圖 1)，其中化合物 1 是一個新的異戊烯基欖烷型二萜. PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員，它在胰島素信號通路中起負調控作用，是一個新穎的治療糖尿病和肥胖癥的靶點. 因此，尋找和開發高效的 PTP1B 抑制劑具有重要的研究價值[7] . 本文對分離到的 10 個化合物進行了 PTP1B 酶抑制活性檢測，發現化合物 3 具有較好的 PTP1B 抑制活性，其 IC50 為 4.83±2.35 μΜ. 本文主要報道新化合物 1 的提取分離、結構鑒定和波譜數據，以及分離得到的 10 個化合物對 PTP1B 抑制活性的篩選結果.

　　1 結果與討論

　　1.1 化合物 1 的結構鑒定

　　化合物 1，無色油狀，HR-ESI-MS 顯示 1 的準分子離子峰 [M+H]+ m/z 319.2630 (計算值 319.2632)，確定 1 的分子式為 C21H34O2，不飽和度為 5. 綜合分析 13C NMR 和 DEPT 波譜數據，發現化合物有 21 個碳信號，包括 1 個羰基(?C 177.5)，2 個 sp2雜化的季碳(?C 140.6, 148.0)， 1個sp3雜化的季碳(?C39.9)，2個sp2雜化的叔碳(?C 122.0, 150.6)，3 個 sp3 雜化的叔碳(?C39.2, 47.7, 53.0)，2 個 sp2 雜化的仲碳(?C 109.9, 112.1)，5 個 sp3 雜化的仲碳(?C25.6, 26.9, 33.1, 34.0, 40.1)，4 個甲基碳信號，1 個甲氧基碳信號. 經過與文獻中相似化合物的波譜數據進行比對，發現化合物 1 與同時分離的異戊烯基欖烷型二萜 (17R)-loba-8,10,13(15)-triene-17,18-diol (2) [8]的 1H NMR 和 13C NMR 數據十分相似，區別主要發生在側鏈上. 在 1H1H COSY 譜中，可見質子信號 H-15 (?H5.13)、 H-16 (?H1.99, 2.01)、H-17 (?H 1.45, 1.74)、H-18 (?H2.45) 有偶合關系(圖 2). 在 HMBC 譜(圖 2)中，質子信號 H-14 [?H1.60(3H, s)]與碳信號 C-4 (?C47.7)、C-13 (?C 140.6)、C-15 (?C122.0)有相關, H-19 [?H1.15(3H, d, J=7.0Hz]與碳信號 C-17 (?C34.0)、C-18 (?C 39.2)、C-20 (?C 177.5)有相關，因此，可以確定側鏈的結構片段，化合物 1 的平面結構如圖 1 所示. 化合物 1 的立體相對構型是通過 NOESY 以及異戊烯基欖烷骨架的經驗規則[9]確定的, H-2 和 H-4 均為 β-取向, H-7 為 α-取向. 在 1H1H COSY 譜中, H3-14 和 H2-16 NOE 的相關將 Δ 13,15 定為 E 構型，通過 QM-NMR 量子力學方法計算兩種可能的構型 1a(1R, 2R, 4S, 18R)或 1b(1R, 2R, 4S, 18S). 通過 DP4+，使用具有 6-31G*基集的 B3LYP 泛函，在 DFT 水平上進行 幾 何 優 化 . 然 后 將 核 磁 共 振 數 據 在 PCM/mPW1PW91/6-31+G**水平上計算，對實驗與計算的 1a, 1b 構型的 13C NMR 化學位移進行回歸分析，得出了最佳擬合構型 1b (圖 3). 最后，將計算數據和實驗數據進行關聯，并評估相應的 DP4+概率，1b 構型顯示出最高的 DP4+概率(99.88%). 因此推測出化合物 1 的最佳匹配構型為 1b(1R, 2R, 4S, 18S). 同時確定了 CH3-19 為 β-取向，并將化合物 1 命名為羅伯塔特.

　　化合物 4，無色油狀，為已知化合物，本文首次確定了其絕對構型. 通過對比具有相似結構單元的已確定絕對構型的化合物的化學位移[10-13]，對比碳譜數據 C-11 (?C69.4)和 C-12 (?C79.3)確定了 11 位的羥基為β取向，12 位的甲基為α-取向、甲氧基為 β-取向.

　　2 結論

　　通過色譜分離技術和波譜技術對矮小短指軟珊瑚 S. nanolobata 的丙酮提取物進行了化學成分研究，共得到 10個化合物，這些化合物均為首次從該動物中分離得到. 包括 6 個二萜類化合物和 4 個甾體化合物. 其中化合物 1 為新化合物，通過經驗規則和 DP4+計算確定了其立體構型. 同時，本文首次確定了化合物 4 的絕對構型. 通過 PTP1B 酶抑制活性實驗篩選，發現化合物 3 對 PTP1B 具有較好的酶抑制活性，表明其在治療糖尿病和肥胖癥的藥物發掘中具有一定的研究價值.

　　3 實驗部分

　　Perkin-Elmer 241MC 旋光測定儀 (PerkinElmer， Fremont，美國);Nicolet iS5 紅外光譜儀 (Thermo Scientific，Waltham，美國);JASCO J-815 圓二色譜儀 (JASCO，日本);Bruker AVANCE III 500 MHz 和 600MHz 核磁共振儀 (Bruker Biospin AG，Fällanden 德國)，以 TMS 信號作為參照;Agilent G6520 Q-TOF 高分辨質譜儀 (Agilent，美國);Agilent 1260 高效液相色譜儀 (Agilent，美國);Agilent Eclipse XDB-C18 半制備色譜柱 (5 µm，9.4 × 250 mm);薄層硅膠板 GF254 和柱色譜用硅膠 (200～300 目，300～400 目，青島海洋化工有限公司，中國);Sephadex LH-20 凝膠 (Amersham Pharmacia Biotech，瑞典);色譜純試劑 (DiKMA，美國)，其他有機溶劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司. 生物樣品矮小短指軟珊瑚于 2017 年采集于中國南海西瑁島海域，經海南大學李秀保教授鑒定為 Sinularia nanolobata，標本(編號：17-XD-99)存放于中國科學院上海藥物研究所新藥研究國家重點實驗室.

　　3.1 提取與分離

　　將冷凍的 S. nanolobata (干重量 700g) 切碎，用丙酮超聲提取 5 次，每次 15 min，合并提取液減壓濃縮后，將丙酮浸膏懸浮于 1 L 水中，分別用等體積的乙醚和正丁醇各萃取 3 次，收集萃取液分別減壓濃縮后得到深棕色的乙醚相浸膏 11.3 g 和正丁醇相浸膏 3.3g. 乙醚相浸膏 (5.5 g) 經硅膠 (200～300 目)柱色譜，石油醚-乙醚 (100:0→95:5→8:2→7:3→6:4→5:5→0:100) 梯度洗脫，分為 6 個組分 Frs.A～F. Fr.A 組分 (1.6 g) 先后經 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷甲醇 2:1:1) 和硅膠(300-400目)柱色譜 (石油醚-乙醚 100:0→95:5)，被分成 5 個亞組分 A1～A5, A2 經半制備 H PLC，以 100%乙腈等度洗脫(2.5 mL/min)得化合物 1 (4. 8 mg，tR = 16.0 min)和化合物 4 (1.7mg，tR =13.8 mi n). A4 經半制備 HPLC，95%乙腈-水等度洗脫(2.5 mL/ min)得化合物 5 (5.1 mg，tR = 16.5 min)和化合物 6 (1 6.7 mg，tR = 17.1 min). Fr.B 組分 (1.6 g) 經 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2:1:1) 層析, 得到化合物 7 (384.2mg). Fr.C 組分(348mg) 先后經 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2: 1:1) 和硅膠 (300-400 目) 柱色譜 (石油醚-乙醚 12:1→1 0:1→5:1→1:1)，被分為 4 個亞組分 C1～C4, C2 經半制備 HPLC, 以 80%乙腈-水等度洗脫(2.5 mL/min)得化合物 2 (2.8 mg，tR = 14.8 min). Fr.D 組分(703.6mg) 經 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2: 1:1) 層析, 得到 6 個亞組分 D1～D6, D5 再經過硅膠(30 0-400 目)柱色譜(石油醚-乙醚 5:1→3:1→1:1,得到化合物 3 (5.5 mg)和化合物 8 (36.0mg). Fr.F 組分(1.2g) 先后經 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷甲醇 2:1:1) 層析和 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (純二氯甲烷) 層析, 得到 4 個亞組分 F1～F4, F4 經半制備 H PLC 80%乙腈-水等度洗脫(2.5 mL/min)得化合物 9 (10 1.4 mg，tR = 7.3 min)和化合物 10 (94.6 mg，tR = 13. 2 min).

　　3.2 結構鑒定

　　化合物 1 無色油狀物, [α] 20 D +12.3(c 0.10, MeOH); HR-ESI-MS [M+H]+ m/z：319.2630 (Calcd. 319.2632)，分子式 C21H34O2; IR (KBr,cm-1 )vmax: 2970、2928、2859、 1739、1436、1375、1197、1159、907.4、890cm-1 ,其 1H NMR 和 13C NMR 數據見表 1. 化合物 2～10 為已知化合物, 根據其波譜數據與文獻比對，將其分別鑒定為(17R)-loba-8,10,13(15)-triene-1 7,18-diol (2) [8]、α-生育醌 (3) [14]、(1E,3Z,7E,11R,12R)- 11-羥基-12-甲氧基-1-異丙基-4,8,12-三甲基-環十四碳-1, 3,7-三烯(4) [11]、(+)-(1E,3E,7E,11R,12S)-11,12-epoxy-11, 12-dihydrocembrene-C(5) [15]、(1E,3E,7R,8S,11E)-7,8-epo xy-1-isopropyl-4,8,12-trimethyl-cyclotetradeca-1,3,11-trien e (6) [15]、24-亞甲基-膽固醇 (7) [16]、孕烯醇酮 (8) [17]、 3β,6α,11-三羥基-24-亞甲基-9,11-斷-5α-膽甾-7-烯-9-酮 (9) [18], Sinugrandisterol A (10) [19] .

　　3.3 生物活性測試

　　PTP1B 通過對胰島素受體或其底物上的酪氨酸殘基去磷酸化作用,對胰島素信號轉導進行負調節，本文利用重組 PTP1B 蛋白對分離的化合物 1～10 進行酶活力抑制活性篩選. 將重組的 PTP1B 蛋白(30 nmol/L)與底物對-硝基苯磷酸鹽(p-NPP,2 mmol/L)以及待測化合物在 MOPs 緩沖液中 30℃孵育. 通過在 405 nm 下檢測底物 p-NPP 被去磷酸化后所產生的對-硝基苯(p-NP)的含量，監測 PTP1B 的酶活力. 結果顯示，化合物 3 對 PTP1B 具有很好的抑制活性，其 IC50 為 4.83±2.35 μΜ. 輔助材料(Supporting information) 化合物 1 的 1D/2D NMR 波譜圖、紅外光譜圖、高分辨質譜圖以及計算方法. 這些材料可以免費從本刊網站(http://sioc-journal.cn/) 上下載.