146份甘藍型油菜種質芽期耐鹽性篩選及評價

　　摘 要 利用6 份甘藍型油菜種質篩選出油菜芽期耐鹽性鑒定的適宜濃度為230mmol·L-1。以該濃度對146 份甘藍型油菜品系進行芽期耐鹽性鑒定，測定發芽勢、發芽率、根長、芽長等指標，通過相關性、主成分、隸屬函數以及聚類分析對油菜種質資源進行耐鹽性綜合評價。結果表明：鹽脅迫下，油菜的發芽勢、發芽率、根長、芽長、相對芽長、相對根長相互之間成極顯著正相關，而與相對鹽害率呈極顯著負相關;主成分分析將7個耐鹽相關指標分為2個主成分，累計貢獻率達91.6%;結合隸屬函數分析和耐鹽性綜合評價，將146份甘藍型油菜耐鹽性分為 4個等級，其中耐鹽材料6 份、中度耐鹽材料 11份、低耐鹽材料64 份和敏鹽材料65 份。這些材料將為甘藍型油菜種質耐鹽性評價和篩選提供參考。

　　本文源自李萍; 燕佳琦; 張鶴; 張燕; 陶順仙; 張琪; Aldiyar; 徐愛遐; 黃鎮， 西北農業學報 發表時間：2021-06-15

　　關鍵詞 甘藍型油菜;耐鹽性;主成分分析;隸屬函數;聚類分析;綜合評價

　　鹽害是危害國家農業生產的主要因素之一，據統計，全球約 20%的耕地受到鹽漬影響，導致作物產量下降，農作物產品質量受到影響[1-2]。植物在鹽害條件下生存和完成整個生命周期的能力取決于其耐鹽性，耐鹽性隨物種和生長期的不同而變化[3-4]。因此，利用鹽堿土的最有效方法是篩選和種植耐鹽作物[5]。油菜作為重要的油料作物，不僅它本身具有多種用途，并且種植油菜后的土壤有機質增加，能有效改良鹽堿地土壤，具有極大的種植潛力[6]。因此，對現有的油菜種質資源開展耐鹽性鑒定，篩選出一批耐鹽性強的種質，并在生產上加以利用，對實現鹽堿地的農業高效利用，提升中國耕地的農業生產能力具有重要意義[7]。

　　研究表明，鹽分主要通過滲透脅迫和離子毒害等方式改變植物的細胞膜透性，造成氧化脅迫和代謝紊亂等現象，從而影響植物種子萌發、生長發育、光合作用和呼吸作用等[8-9]。植物耐鹽性體現于不同生育階段，芽期是植物形態建成的最早時期，是對鹽脅迫最敏感的時期之一[10]。因此，在大規模篩選耐鹽的優良種質時，可以選擇芽期作為快速評價種子耐鹽能力的重要時期。但是，對于不同物種來說，其萌發期的耐鹽性評價指標和方法各不相同，目前已經對小麥[11]、水稻[12]、花生[13]和大豆[14]等多種作物開展了耐鹽性篩選鑒定。田蕾等[15]發現水稻芽期對鹽脅迫較為敏感，同時利用逐步回歸和主成分分析獲得3 個重要指標(發芽指數、相對根長和相對鹽害率)，并構建了水稻芽期耐鹽性評價模型，可以作為預測和鑒定粳稻發芽期的耐鹽性的有效方法。 孫 璐等[16]利用42 個高粱品種確定根長、鮮質量和發芽率可以作為大批量鑒定高粱品種耐鹽性的指標，并在此基礎上獲得5 份高度耐鹽高粱品種。Adjel等[17]以12 份大麥品種為材料進行芽期和幼苗期耐鹽鑒定，發現在發芽階段，根長和發芽率最能區分敏鹽和耐鹽品種之間的差異，而在幼苗生長階段，芽鮮質量的 K+ ，Na+ 和 K+/Na+ 比率是區別不同品種耐鹽能力的指標。盡管國內外已開展了關于作物耐鹽性的鑒定與研究，但對于油菜發芽期耐鹽性鑒定和品種篩選研究較少。龍衛華等[18]采用梯度濃度中性鹽脅迫15 個不同遺傳背景的甘藍型油菜自交系，提出214mmol·L-1鹽為鑒定油菜品系耐鹽性的最適濃度，根長和莖長可以作為評價油菜耐鹽性的早期評價指標，并得到了2份最耐鹽品系和1份鹽敏感品系。虎滿林等[19]在油菜種子萌發期鑒定了 15份春油菜種質的耐鹽性，提出春油菜耐鹽種質篩選及評價研究的最佳鹽質量濃度(10g/L)，但沒有提出有效的篩選指標，且研究的種質資源較少，具有一定的局限性。綜合來看，從大量的油菜種質資源中快速有效地篩選出可利用的耐鹽材料，目前還沒有可靠有效的評價體系和篩選方法。

　　本研究以146 份甘藍型油菜品系為研究材料，在油菜發芽期進行鹽脅迫處理，調查相關的形態指標，運用主成分、隸屬函數法、聚類分析等不同評價方法，對油菜種質發芽期耐鹽特性進行綜合評價，以期篩選出油菜發芽期耐鹽性強的材料，為鹽堿地區油菜的耐鹽優異資源發掘和新品種培育提供理論支撐及材料來源。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　146 份油菜種質資源均為甘藍型油菜，它們來源或系譜明確，親緣關系較遠，遺傳變異豐富，種子均由西北農林科技大學油菜課題組提供(表1)。

　　1.2 確定適宜的鹽脅迫濃度

　　以遺傳 背 景 不 同 的 6 份油菜種質為材料(827、1006、1106、1164、1296、1583)，挑選大小均勻的油菜種子，設置6個鹽濃度，分別為0、100、150、200、250、300 mmol·L-1，每個處理設置 3個重復，每個重復用種50粒。種子消毒處理并用蒸餾水清洗后放入直徑90mm 玻璃培養皿中，加入 7.5mL的 鹽 溶 液，并將其置于相對濕度為54%，溫度為25 ℃(16h 光照/8h 黑暗)的油菜生長室。第3 天記錄發芽種子數，第7 天調查發芽率，第8 天從每重復中隨機選取10 株幼苗，測量胚根長和胚芽長，發芽的標準為胚根長度≥種子長度的一半。

　　1.3 油菜芽期耐鹽種質的篩選

　　試驗組加入230mmol·L-1鹽溶液，對照組加入等量蒸餾水，設置3 個重復，每個重復用種50 粒，重復“1.2”的方法調查相關指標。

　　發芽勢=3d發芽的種子數/供試種子數 × 100%;發芽 率 =7 d 正 常 苗 數/供 試 種 子 數 × 100%;發芽相對鹽害率=(對照發芽率-處理發芽率)/對照發芽率×100%;相對根長=處理根長/對照根長×100%;相對芽長=處理芽長/對照芽長×100%

　　1.4 數據處理

　　采 用 MicrosoftExcel2013 和 IBM.SPSSStatistics20.0 進行數據處理和統計分析。參照張會麗等[20]的方法，利用公式(1)(2)(3)計算各份材料單項指標的隸屬函數值和平均隸屬函數值;參照劉丙花等[21]的方法，利用公式(4)(5)計算各個綜合指標的權重(Wj)和油菜耐鹽綜合評價值(CEIj)。利用系統聚類法，將各個發芽指標以歐式距離作為油菜種質間距離進行聚類分析，建立種質資源聚類樹狀圖。

　　正項 指 標 隸 屬 函 數 值 U (Xij )= (Xij -Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，i=1，2，3，…，m;j=1，2，3，…，n (1)負 項 指 標 隸 屬 函 數 值 U (Xij )= (Xmax -Xij)/(Xmax-Xmin)，i=1，2，3，…，m;j=1，2，3， …，n(2)平均隸屬函數值 ASF=1/m，∑mj=1Uj，j=1，2，3，…，n (3)綜合指標的權重 Wj =Pj/∑kj=1，Pj，j=1，2，3，…，k (4)各個材料綜合指標對鹽害耐性綜合評價值CEIj= ∑mj=1，[Zj×Wj]，j=1，2，3，…，k(5)

　　式(1)(2)中，Xij表示第i份材料第j 個指標的實測值，Xjmax為第j 個指標的最大值，Xjmin為第j個指標的最小值。當耐鹽指標與種質耐鹽能力呈正相關，用公式(1);而對于相對鹽害指數來說，該指標與耐鹽能力呈負相關，則用公式(2)。公式(3)中，Uj 表示每份材料的第j 個指標的隸屬函數值。式(4)中，Wj 表示第j 個綜合指標在所有綜合指標中的權重;Pj 表示經主成分分析所得到各材料第j 個綜合指標的方差貢獻率，k 為選取的主成分個數。式(5)中，Zj 表示各個主成分的得分值。

　　2 結果與分析

　　2.1 篩選油菜耐鹽種質的適宜鹽濃度

　　為了確定芽期耐鹽篩選的適宜鹽濃度，挑選6 份遺傳背景不同的材料在不同的鹽濃度下進行處理。由表2、表3可知，低濃度(100 mmol·L-1)下，6份材料發芽勢和發芽率較對照差異均未達到顯著，高濃度(300mmol·L-1)時，僅有個別種子發芽，說明高濃度鹽脅迫顯著降低種子的發芽速度。鹽濃度為 200mmol·L-1時，材料1164、1583的種子發芽率較對照比差異不顯著，材 料1296、827、1106和1006與對照差異顯著，鹽濃度為 250mmol·L-1時，6份材料與對照相比，種子發芽勢和發芽率差異均達到顯著水平，說明鹽濃度為200～250 mmol·L-1可 以 有 效 區 分 各 品系的耐鹽能力。隨后對該濃度區間進行細化(0、200、210、220、230、240和250mmol·L-1)，由圖1看出，在 230mmol·L-1鹽濃度下，各份材料的萌發差異較大，可有效區分各份材料間的耐鹽差異，因此，本研究選用 230 mmol·L-1作為篩選油菜耐鹽種質的適宜處理濃度。

　　2.2 油菜芽期耐鹽指標的變異分析

　　在230mmol·L-1鹽脅迫下，146 份油菜種質的發芽勢、發芽率、相對鹽害率、根長與芽長差異性較大，變異系數分別為 136%、107%、20%、48%、77%、75% 和81%(表4)。這表明參試油菜材料耐鹽相關性狀變異豐富，性狀指標存在較大差異，可以指示品種的耐鹽性，用于油菜種質的耐鹽性鑒定。其中有4 份種質未發芽，相對鹽害率達到100%。有4 份種質發芽率達70% 以上，對鹽脅迫的抗性能力較強。綜合來看，種子發芽勢和發芽率集中在20% 以下，芽期相對鹽害率主要分布在80% 以上，芽長和根長小于0.2cm 的種質分別占21.2% 和37.0%(圖2)，說明鹽脅迫嚴重抑制根和芽的生長和發育。

　　2.3 鹽脅迫下油菜各指標的相關性分析

　　發芽勢、發芽率、根長、芽長、相對根長和相對芽長中，任意兩個指標之間均呈極顯著正相關，其中發芽勢與發芽率的相關系數最大為 0.967，而發芽率與相對芽長的相關系數最小為 0.358;發芽相對鹽害率與發芽勢、發芽率、根長、芽長、相對根長和相對芽長呈極顯著負相關，其中與發芽勢、發芽率的相關系數較大，分 別 為 -0.967和-1.00(表5)。因此，鹽脅迫下油菜各指標之間存在不同程度的相關性。

　　2.4 主成分分析

　　為確定篩選油菜芽期耐鹽性的主要指標，對146份自然群體的 7個性狀進行主成分分析(表6)。通過主成分分析，根據各主成分的特征值和貢獻率進行主成分提取。特征值大于1的主成分有2 個，第一主成分的特征值為4.617，方差貢獻率達65.964%;第二主成分的特征值為1.795，方差貢獻率是25.644%，這兩個主成分累計方差貢獻率達91.6%(表6)，可代替7 個萌發指標的絕大部分信息，綜合反映鹽脅迫下油菜芽期的萌發特性，可以作為油菜耐鹽種質評價的綜合指標。

　　由表6和表7可知，對第一主成分產生正向影響的指標有發芽率、發芽勢、根長、芽長、相對根長、相對芽長，載荷數都比較高，都在0.76 以上。載荷較高但對第一主成分產生負向影響的指標是相對鹽害指數，其數值為-0.802。對第二主成分產生負向影響的指標有發芽勢和發芽率，載荷數為-0.584 和-0.593，相對鹽害指數和相對芽長為較高的正載荷指標，載荷值為0.5 以上。

　　2.5 基于平均隸屬函數值、綜合評價指數值的油菜耐鹽綜合評價

　　平均隸屬函數值(ASF 值)和綜合評價指數(CEI)，作為評價耐鹽性強弱標準的度量值，ASF值和 CEI值越大，耐鹽性越強。利用公式(3)計算油菜種質的平均隸屬函數值 (ASF 值)，并 對146份油菜種質進行排序(表1)。平均隸屬函數值為0.00～5.33，綜合排名前十的種質從大到小依 次 為 1164、1462、928、862、1028、861、1624、1030、1185和1395，綜合排名后十的種質從小到大依次為962、1352、1032、1079、940、1047、1334、1006、1484和1497。將發芽指標原始數據標準化后，利 用 公 式 (5)計 算 綜 合 評 價 指 數 (CEI=0.72Z1+0.28Z2 )。 綜 合 評 價 指 數 為 -2.51～4.76，146 份油菜種質耐鹽性強的種質綜合排名前 十 的 是 928、1164、1028、1624、1462、1030、1395、1613、862和1185。敏鹽材料依次為1352、962、1032、940、1334、1497、1079、1047、1006 和1413。本試驗用這2 種綜合評價體系來評價146份油菜種質的耐鹽情況，結果表明，146 份材料在不同評價體系中排名略有不同，但排名順序差異不大，耐鹽材料和敏鹽材料的篩選結果基本一致。

　　2.6 聚類分析

　　基于耐鹽綜合評價指數(CEI)，通過最遠距離法進行系統聚類，在歐氏距離為5處將146 份油菜種質分為四大類(圖3)。第Ⅰ類為高度耐鹽材料，包括 928、1164、1624、1462、1030 和 1028;第Ⅱ類為中度耐鹽材料，包括1395、1613、862和861等 11 份;第 Ⅲ 類 為 低 耐 鹽 材 料，包 括 853、1210、1075、1098、1649和1650等64 份;第Ⅳ類為敏 鹽 材 料，包 括 1006、1032、1047 和 1352 等65份。

　　3 討 論

　　目前，中國土壤鹽漬化十分嚴重，而通過種植耐鹽作物對鹽漬土進行生物改良是目前最為經濟、最有效的途徑[22]，這對油菜的耐鹽性提出了更高的要求。中國作為白菜型油菜和芥菜型油菜的起源中心，種質資源豐富，遺傳變異較為廣泛，這為開展油菜優良種質資源研究與創新提供了重要的材料基礎[23]。因此，加強現有油菜種質資源耐鹽性的系統評價和利用，對選育耐鹽油菜新品種具有極大的現實意義。本試驗探究6個不同鹽濃度對6 份遺傳背景不同材料的影響，結果發現200～250mmol·L-1鹽濃度可以鑒定不同材料耐鹽的差異性，為了快速篩選出高度耐鹽材料，試驗最終選擇230 mmol·L-1作為本試驗的篩選濃度，與龍衛華等[18]認為214mmol·L-1的鹽濃度最適于鑒定耐鹽性的研究結果接近。以該濃度對146 份種質材料進行芽期耐鹽性綜合評價，研究發現，230 mmol·L-1濃度的鹽脅迫下，發芽勢、發芽率和芽長的變異系數分別為 136%、107%和81%，進一步表明油菜種質資源的耐鹽性存在廣泛變異。

　　鹽脅迫下，油菜種子的發芽勢、發芽率、根長、苗長及根數等形態指標呈現不同程度的下降[24]。目前，油菜耐鹽性篩選指標并沒有統一的標準。但有研究表明，發芽勢和發芽率在油菜各個品種之間差異很大，可以作為指示油菜鹽逆境反應的指標[25];劉自剛等[26]認為鹽敏感品系的胚根長/胚芽長比值顯著高于耐鹽品系，耐鹽品系胚根伸長對鹽脅迫更加敏感，也可以將胚根長作為篩選耐鹽材料的指標;Irandokht等[27]對300 份油菜種質進行早期耐鹽篩選，結果發現鹽脅迫下種子的發芽率降幅最大，而發芽率、出苗率、地上部和根的長度及質量是油菜耐鹽性篩選的重要指標;Wu等[28]通過芽鮮質量這一指標建立數學評價模型，能預測甘藍型油菜萌發期的耐鹽能力，可以作為大規模篩選油菜耐鹽性的可靠指標。本研究通過相關性分析，發現發芽勢、發芽率、根長、芽長、相對根長和相對芽長之間相互呈極顯著正相關，而與發芽相對鹽害率呈極顯著負相關，部分相關系數達0.9 以上，各個指標相關性極為明顯。這些指標對耐鹽綜合評價指標的貢獻率不同，因此，如果想要準確反映某一油菜材料的耐鹽性，應當盡可能調查多個指標進行綜合分析，才能全方位反映油菜種子的耐鹽性。

　　近年來，隨著作物抗逆性研究的發展，利用主成分分析、平均隸屬函數值法和聚類分析等對大豆[29]、花生[30]、油菜[31]、高粱[32]和馬鈴薯[33]等作物進行抗逆性篩選鑒定，已經成為綜合評價作物抗逆性的有效且可靠的方法。本研究通過測定油菜發芽期相關指標，分析各個耐鹽指標的相關性，并采用主成分分析法綜合分析各個指標在耐鹽性分析中所占的權重，基于平均隸屬函數值、綜合評價指數值對所有供試材料的耐鹽性進行綜合評價并排序。最后通過聚類分析，將146 份油菜種質耐鹽性分為四大類。通過不同的評價體系，綜合篩選出 6 份 高 度 耐 鹽 的 材 料，包 括：1164、928、1624、1462、1030和1028。其中1164品系的平均隸屬函數值(ASF值)為5.33，排名第1，綜合評價指數(CEI)為4.52，排名第2 ，在2 種評價體系中綜合表現最好，耐鹽性最強。但由于作物在不同生長發育階段所表現的耐鹽性可能存在一定差異，在發芽期篩選出的耐鹽性較好的油菜種質是否在苗期或者成株期表現出相同的特性還有待于進一步驗證。

　　4 結 論

　　本研究通過鹽濃度梯度試驗篩選出甘藍型油菜芽期耐鹽處理的適宜濃度為230mmol·L-1，在該鹽濃度處理下測定了146份甘藍型油菜芽期耐鹽相關形態指標，利用相關性分析、主成分分析、隸屬函數法和聚類分析等分析方法對146份甘藍型油菜的耐鹽性進行綜合評價，篩選出6份強耐鹽的甘藍型油菜種質。本研究為甘藍型油菜耐鹽性評價以及耐鹽性育種提供了參考。