東方百合ANS基因的克隆與對擬南芥過表達的表型分析

　　摘 要 ANS 為花青素植物花青素合成途徑末端的關鍵酶基因，通過東方百合材料克隆獲得 3 個 ANS 同源基因，解析堿基水平和氨基酸水平上的差異對基因轉錄水平及表型影響，深入研究百合 ANS 的功能特性，進一步完善百合花色形成的分子機理奠定理論基礎。選取東方百合‘西伯利亞’品種為材料，通過同源克隆技術鑒定了 LsANS1、LsANS2、LsANS3，分別構建其過表達載體，花序侵染法轉化擬南芥，經潮霉素抗性篩選及分子檢測獲得陽性植株。利用電子解剖鏡觀察和 qRT-PCR 定量分析表達量差異，驗證野生型與轉基因植株后代的表型差異。LsANS1 與 LsANS3 高度同源，轉基因陽性植株主莖上分布明顯紅色，可能是由于 DIOX_N (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal, 嗎啡合成 N-端的非血紅素加氧酶)亞家族結構域上的個別堿基的變異導致基因表達水平而發生了表型差異;LsANS2 與其他兩個同源基因存在氨基酸序列上的差異，基因表達水平上遠遠低于其他兩個同源基因，表型上出現略微淡紅色。

　　本文源自楊成龍; 張潔; 方少忠; 鄭益平; 林智敏， 分子植物育種 發表時間：2021-06-17

　　關鍵詞 百合; ANS; 花青素; 功能分析

　　花青素是一種重要的植物水溶性色素，在結構上屬于類黃酮化合物，是植物器官顯色的主要色素(張彬等 , 2014; 顧林等 , 2007) 。 無 色 花 青 素 雙 加 氧 酶 / 花 青 素 合 成 酶 (Leucoanthocyanidin Dioxygenase/Anthocyanidin synthase, LDOX/ANS)位于花青素生物合成途徑末端，作用于花青素生物合成的倒數第二個步驟，其產物是花色素生物合成途徑的第一個顯色化合物，能夠使無色花色素轉換有色花色素的(Liu et al., 2010; Nakajima et al., 2001; 亓希武等, 2013)。ANS 基因首次分離是在紫蘇(Saito et al., 1999)上實現，后續在山藥(周生茂等, 2009)、金蕎麥(卜星星等, 2014)、芥藍(趙蓉蓉等, 2010)、桑樹(亓希武等, 2013)、蕪菁(許志茹等, 2009)等多種植物中都分離出了 ANS 基因。

　　百合(Lilium brownii var. viridulum Baker)是百合科百合屬球根花卉，因其觀賞價值而成為著名的切花品種、園林植物和盆栽植物(Theissen, 2001)。由于花色是觀賞植物的重要形狀之一，影響著觀賞作物的商業價值(Burchi et al., 2010; Kelley et al., 2001)，因此在百合的育種研究上，尤其是分子育種方向，對于花色素方面的研究工作成為熱門領域。近年來，百合花青素相關基因的研究工作取得了較大的進展，但主要的深入研究都集中在 CHS，如 LCH2 (楊麗等, 2006)以及 CHS 啟動子在轉基因植株中能驅動外源基因的表達(常小麗, 2008)，花青素合成酶的研究則主要集中在 bHLH 與 MYB 轉錄因子的對應調控(Yamagishi et al., 2010; Koes et al., 2005)。然而，對下游結構基因的調控對百合花色素合成的影響機制目前仍知之甚少。

　　此外，過量表達 ANS 基因增加轉基因植株花青素的含量在多個物種上都已經被驗證可行(亓希武等, 2013)、(孫海燕, 2015)、(Reddy et al., 2007)，但 ANS 的表達受多種因素影響，其中自身序列編碼區核苷酸插入與缺失也會影響基因表達(Ben et al., 2015; Nakatsuka., 2012)。根據前人對 ANS 基因的研究基礎，為進一步探究基因表達是否會受基因編碼區的 SNP 位點以及編碼區核苷酸插入與缺失影響，本研究在百合 ANS 的功能研究上選取東方百合‘Siberia’品種，分離 3 個 ANS 同源基因，分別構建過表達載體，轉化擬南芥進行表型觀察，同時結合結構域的堿基差異、氨基酸差異與基因轉錄水平高低及表型差異進行對應研究，旨在進一步深入解析 ANS 基因的表達特性，探討不同堿基位點的差異對百合 ANS 的轉錄水平與花色素合成的影響，為完善百合花色素形成的分子機理提供一定的理論基礎。

　　1 結果與分析

　　1.1 基因克隆及序列分析

　　由于東方百合栽培種‘西伯利亞’為高度雜合品種，經同源克隆后分離得到 3 個 ANS 基因，分別命名為 LsANS1、LsANS2、LsANS3，全長序列分別為 1 080、1 026、1 080 bp。堿基比對結果表明，LsANS1 與 LsANS3 同源性更高，僅在第 186 個堿基、第 195 個堿基與第 243 個堿基存在差異。差異堿基所在區域為 DIOX_N (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal, 嗎啡合成 N-端的非血紅素加氧酶)亞家族結構域 (O'Shaughnessy et al,1999)。而經氨基酸序列比對(圖 1)，LsANS1 與 LsANS3 在氨基酸序列上并無差異，而 LsANS2 在第 8 個氨基酸與第 346、347 個氨基酸與其他兩個同源基因存在差異，該差異不在蛋白結構域中。

　　1.2 過表達轉基因植株的陽性篩選

　　通過潮霉素對 T1 代擬南芥種子進行抗性篩選，獲取陽性克隆，同時 PCR 檢測潮霉素抗性基因(Hyg)，結果顯示抗性植株含有目的條帶，大小約 875 bp (圖 2)。

　　1.3 過表達轉基因植株后代的表型分析

　　擬南芥的陽性純合植株通過電子解剖鏡觀察表型發現(圖 3)，相較于野生型，轉基因擬南芥在幼苗期出現明顯的表型，過量表達 LsANS1 與 LsANS3 的轉基因植株在主莖處出現明顯的紅色，而過量表達 LsANS2 的轉基因植株體則出現略微的紅色。結果表明，在擬南芥幼苗期，相較于過量表達 LsANS2,過量表達 LsANS1 與 LsANS3 能明顯促進轉基因擬南芥花青素含量增加。

　　1.4 過表達轉基因植株 LsANS 的相對定量分析

　　以百合 ACTIN 基因作為內參基因，對野生型(WT)、LsANS1、LsANS2、LsANS3 的基因表達水平進行定量分析。結果表明(圖 4)，與野生型植株相比，LsANS3 表達量最高，達 708.36 倍，其次是 LsANS1，達 413.85 倍，LsANS2 表達量介于于其他兩個同源基因之間，表達量相對較低，達 95.04 倍。

　　2 討論

　　花青素合成酶作為花色素合成途徑末端的酶，對花和果實的著色起著關鍵作用，前人在多個物種中 的研究表明 ANS 基因是花青素生物合成的重要結構基因(李霞等, 2014)。本研究選擇東方百合栽培種‘西伯利亞’為材料，分離得到 3 個 ANS 同源基因，分別構建過表達載體轉化擬南芥植株進行表型觀察，實驗結果顯示過表達 ANS 主要在轉基因擬南芥幼苗期出現明顯表型，轉基因擬南芥在主莖處出現紅色著色現象，該現象與亓希武等(2013)過表達楊樹 ANS 基因轉化擬南芥后出現的表型變化一致，進一步驗證了過量表達 ANS 基因能夠促進植株花青素的積累。在轉基因植株表型改變上，不同的轉基因擬南芥間也存在著差異， 過表達 LsANS1、LsANS3 的擬南芥幼苗主莖上出現較為明顯的紅色，而過表達 LsANS2 的轉基因擬南芥幼苗則紅色著色情況不明顯;基因表達定量分析表明，LsANS1 和 LsANS3 表達量遠高于 LsANS2。本研究同時對 LsANS1、LsANS2、LsANS3 基因全長進行堿基序列和氨基酸序列進行比對，差異分析發現 LsANS1 與 LsANS3 同源性好于 LsANS2，LsAN2 第 8 個氨基酸與第 346、347 個氨基酸與其他兩個同源基因存在差異，氨基酸序列的改變導致在轉基因植株表型上出現不同的表型結果，LsAN3 與 LsANS1 在 DIOX_N (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal, 嗎啡合成 N-端的非血紅素加氧酶)亞家族結構域上存在個別堿基的差異，即使不改變氨基酸序列，也引起了基因表達水平的差異變化。

　　通過轉基因技術過量表達 ANS 基因增加花青素含量對培育豐富色彩的園藝植物和選育富含花青素的優良農作物品種具有重要意義，作物育種中，Reddy 等(2007)在水稻過量表達 ANS 基因，獲取了種皮呈紫紅色的轉基因水稻。本文通過對百合 ANS 基因型與表型的對應關系，將為培育豐富花色的百合品種提供了一定的理論基礎。

　　另外，研究表明 ANS 基因的表達存在時期特異性，在煙草(Lim et al., 2013)、草莓(Bae, 2008)、田薯(陳躍華等, 2015)、杜鵑花(Nakatsuka et al., 2008)等多個物種上均有報道。研究轉基因植物僅在幼苗期出現表型變化，而在花色的著色上并未發現有明顯的差異，該結果與孫海燕(孫海燕, 2015)的研究結論一致，由于可見，在花色形成的機理過程中，ANS 基因并非花色性狀的主效基因，然而 ANS 基因能夠催化無色花色素向有色花色素轉變從而改變植株顏色，是花青素合成途徑的關鍵酶基因，本研究的結果也揭示了過表達單一 ANS 基因不足以引起植株花色的改變卻能改變植株體苗期的色素累積，說明 ANS 基因在色素形成的過程中起到了關鍵作用，本研究將進一步為百合 ANS 基因的改良利用提供了可靠的改良位點，同時為百合花色形成的分子機理奠定了一定的理論基礎。因此，在后續對百合花色的分子改良中，可結合 ANS 基因與其他花青素合成途徑的結構基因和轉錄因子共同調控來實現百合花色的改良。

　　3 材料與方法

　　3.1 試驗材料

　　東方百合‘西伯利亞’來源南平市延欣園藝科技有限公司保存，植物總 RNA 提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、大腸桿菌 DH5a 感受態細胞購自廈門泰京生物技術有限公司。引物由福州白鯨生物科技有限公司合成。擬南芥種子、農桿菌 LBA4404、中間載體 pGXT 和 pCXUN 過表達載體質粒由實驗室保存。

　　3.2 LsANS 基因克隆

　　利用 RNAprepure 多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒提取百合花瓣總 RNA，反轉錄成 cDNA。用引物(表 1)分別擴增 LsANS 序列，回收目的基因片段。連接 pGXT 載體，轉化大腸桿菌 DH5a，提取質粒 DNA，經酶切驗證，將陽性質粒送福州鉑尚生物科技有限公司完成測序。

　　3.3 過表達載體構建及農桿菌

　　利用 XcmI 酶切 PCXUN 載體，回收大片段;PCR 擴增質粒 pGXT-LsANS，回收小片段 LsANS。采用 T4 連接酶連接過夜后轉化大腸桿菌，經篩選獲得重組質粒 pGXUN-LsANS。采用電擊法轉化農桿菌 LBA4404。挑取農桿菌單克隆提取質粒，并進行 PCR 驗證。挑選陽性克隆搖菌，-80 ℃冰箱甘油保存，用于擬南芥侵染備用。

　　3.4 擬南芥種植及侵染

　　播種前將擬南芥種子放置于 4 ℃冰箱春化 3 d，將營養土裝盆播種擬南芥，待其抽薹開花后進行花序侵染。將冷凍保存的農桿菌菌液活化培養后用于侵染擬南芥。活化后的農桿菌菌液加入 15 μL 表面活化劑 Silwet-77，震蕩混勻，利用 Floradip 法侵染擬南芥，剪去已經開過的擬南芥的花與籽粒莢，留下花蕾備用。將擬南芥花器浸入農桿菌懸浮液 30 s 并套袋處理，重復侵染 2~3 次。收集成熟種子(T1 代)后放置 37 ℃烘干，之后置于 4 ℃保存。

　　3.5 轉基因植株體的陽性篩選及表型觀察

　　將存于 4 ℃的 T1 代種子取出后用 75%乙醇消毒 10 min，無菌水過濾 3 次，轉移至含潮霉素的篩選培養基。待擬南芥小苗長出 4 片真葉時進行移栽。待移栽盆中培養 7 d 后，利用 DNA 提取試劑盒進行葉片 DNA 基因組提取，經 PCR 擴增潮霉素抗性基因 Hyg 及目的基因 LsANS 檢測陽性植株，對陽性植株進行單株收種(T2 代)，其余后代按同樣方式進行篩選種植，觀察各代植株的植株體顯色情況，直到收獲純合植株。

　　3.6 過表達擬南芥植株 LsANS 基因的熒光定量 PCR

　　根據百合已登錄序列設計特異性引物(表 1)，由福州鉑尚生物科技有限公司合成。應用 Applied Biosystems® QuantStudio®熒光定量 PCR 儀進行熒光檢測，反應體系為：2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL，各樣品的 cDNA 2 μL，Forward Primer 和 Reverse Primer (濃度 10 μmol/L)各 0.4 μL，用 ddH2O 補足體積至 20 μL。qRT-PCR 的反應程序為：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 30 s，40 個循環。試驗設計 3 個重復，數據讀取由儀器自動完成，通過溶解曲線分析確定擴增產物的特異性。以 ACTIN 為內參基因，采用采用 2 -ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)進行數據的相對定量分析。