紫外線(ultravioletradiation，UV)波長(zhǎng)范圍為10～400nm，依據(jù)其波長(zhǎng)可將其分為短波紫外線(UVC200～280nm)、中波紫外線波長(zhǎng)(UVB280～315nm)和長(zhǎng)波紫外線(UVA315～400nm)3個(gè)區(qū)段。UVA、UVB和UVC在紫外輻射總量中的比例為12∶3∶1(聶穎等，2010)。由于近一個(gè)世紀(jì)全球快速的工業(yè)發(fā)展導(dǎo)致臭氧空洞的產(chǎn)生，加劇了紫外線，尤其是長(zhǎng)波紫外線對(duì)地球上生物體的輻射(翟興禮和史本林，2000;柯惟中和周殿鳳，2004)。雖然適量的紫外線可以促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝，然而過(guò)量的紫外線照射對(duì)生物體是極其有害的，尤其是UVA與UVB。目前，對(duì)紫外輻射的生物效應(yīng)已有大量的報(bào)道，但主要集中在UVB的生物學(xué)效應(yīng)方面(王靜等，2009;趙海濱等，2009)，對(duì)UVA的生物學(xué)效應(yīng)則大多見(jiàn)于植物學(xué)方面的研究，動(dòng)物方面的研究則大多集中于對(duì)離體細(xì)胞培養(yǎng)材料的研究，偏重其機(jī)理的探討(Araielal．，2000;Lielal．，2007)。對(duì)于UVA照射后，在體器官的損傷鮮有報(bào)告。暴露于紫外線照射中的動(dòng)物，其腎臟不僅同樣受到紫外輻射的損傷，而且還需要承擔(dān)機(jī)體在損傷后產(chǎn)生的異常代謝物的排泄以及由此引起的再次損傷，因此使得腎臟成為機(jī)體損傷程度的重要檢測(cè)組織之一(謝妮等，2002;白咸勇和諶宏鳴，2007)。然而，紫外線對(duì)兩棲動(dòng)物腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。花背蟾蜍是北方的廣布種，成體平均體長(zhǎng)在60mm左右。在遼寧省一般于10月中下旬開(kāi)始逐漸進(jìn)入冬眠期，在第二年的4月底出蜇;5月初開(kāi)始產(chǎn)卵，產(chǎn)卵期一般在15d左右。近年來(lái)，已有很多學(xué)者利用花背蟾蜍進(jìn)行了大量的研究，并認(rèn)為花背蟾蜍是很好的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料(柳殿均，1986)。由于照射儀器空間的制約，故選取了亞成體作為照射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本文旨在通過(guò)對(duì)花背蟾蜍(Buforaddei)腎臟組織學(xué)和組織化學(xué)的觀察，揭示其在一定劑量長(zhǎng)波紫外線處理后的結(jié)構(gòu)變化，為分析紫外輻射對(duì)兩棲動(dòng)物種群衰減的機(jī)理積累科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)用亞成體花背蟾蜍，于2010年6、7月采自沈陽(yáng)北陵公園。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)養(yǎng)殖3～4d后，選取體長(zhǎng)在33.7mm±9.8mm的57只花背蟾蜍，雌雄兼用，隨機(jī)分組，共分19組，每組3只。用WD-9403B型紫外儀進(jìn)行照射處理，UVA照射波長(zhǎng)為365nm，輻射量為352μW•cm－2，照射時(shí)間為150、300及450min3個(gè)時(shí)間段。完成照射后，不同照射組各取出一組進(jìn)行立即取材，即立即取材組。其他組繼續(xù)正常飼養(yǎng)3、6、9、12和15d后，分別再各取一組進(jìn)行取材，即恢復(fù)組。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組，每組3只。將亞成體花背蟾蜍用乙醚麻醉后，剖開(kāi)腹腔，立即取出腎臟固定于10%中性福爾馬林24h。常規(guī)石蠟切片，腎臟橫切，厚度7μm，HE、PAS染色。O-LYMPUS-BX50顯微鏡下進(jìn)行觀察、OLYMPUSDP71拍照，運(yùn)用Image-ProExpress6.0圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量。間隔3～5張組織切片選取一張進(jìn)行測(cè)量，且僅測(cè)量切片中切面較大的腎小體及管腔呈圓形的腎小管，測(cè)量數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS16.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-wayANOVA)。文中運(yùn)用到的計(jì)算公式:腎小體相對(duì)面積=(腎小體面積/對(duì)應(yīng)腎臟橫切面積)×100%腎小球相對(duì)面積=(腎小球面積/對(duì)應(yīng)腎臟橫切面積)×100%近、遠(yuǎn)曲小管管徑和細(xì)胞相對(duì)高度=(近、遠(yuǎn)曲小管管徑和細(xì)胞高度/對(duì)應(yīng)腎小體長(zhǎng)徑)×100%

2結(jié)果與分析

2.1花背蟾蜍腎臟的一般結(jié)構(gòu)

花背蟾蜍腎臟呈暗紅色，長(zhǎng)橢圓形，位于體腔背壁、脊柱的兩側(cè)。腎單位為腎臟的結(jié)構(gòu)和功能單位，由腎小體和腎小管構(gòu)成。腎小體呈飽滿的圓形，一側(cè)可見(jiàn)清晰的“彎月”狀的腎小囊腔，其囊壁扁平細(xì)胞連續(xù)而光滑(圖1-1)。腎小體主要分布在腎臟中央和腹緣，背緣和兩側(cè)緣則分布較少，其平均面積為6278.03μm2±1694.90μm2。近曲小管上皮細(xì)胞胞體飽滿，細(xì)胞界限不清，胞質(zhì)嗜酸性，核圓形，位于細(xì)胞近基底部，腔面具刷狀緣，管腔小或無(wú)，基部有縱紋。遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞染色較淺，細(xì)胞界限較為清晰，胞核為圓形或橢圓形，位于細(xì)胞近中部;腔面無(wú)明顯刷狀緣，基部縱紋明顯。PAS染色顯示近曲小管管腔面呈強(qiáng)陽(yáng)性;腎小球內(nèi)部也呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖1-8)。

2.2UVA照射后腎臟結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1腎小管

UVA照射后立即取材，花背蟾蜍腎小管損傷主要表現(xiàn)為小管管徑和上皮細(xì)胞均出現(xiàn)明顯收縮;管壁細(xì)胞間出現(xiàn)明顯縫隙，細(xì)胞基膜也呈間斷性破損，導(dǎo)致小管管壁的破裂;部分管壁細(xì)胞出現(xiàn)胞核外排和局部核聚集的現(xiàn)象。同時(shí)，胞核有較為明顯的縮小和變形，失去原有的圓形或橢圓形的規(guī)則形狀，呈不規(guī)則狀。近曲小管PAS陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)，均有向管腔面和胞質(zhì)內(nèi)擴(kuò)展的現(xiàn)象，且擴(kuò)展區(qū)域著色在原腔面兩側(cè)逐漸減弱。與對(duì)照組相比，300min組腎小管組織學(xué)結(jié)構(gòu)的完整性損傷程度最為嚴(yán)重，由于腎小管管徑的收縮，導(dǎo)致各管間距明顯增加(圖1-3);而150min組整體損傷程度介于300min組與450min組之間(圖1-2、1-4)。

在恢復(fù)期中，近曲小管組織學(xué)結(jié)構(gòu)的損傷，如管壁的完整性、胞核形態(tài)的不規(guī)則、胞核丟失或聚集現(xiàn)象等，在6d或9d有一個(gè)明顯的加劇趨勢(shì)，隨后又逐漸恢復(fù)，即結(jié)構(gòu)的恢復(fù)呈現(xiàn)“U”型現(xiàn)象。在15d時(shí)，150min組近曲小管管壁結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，僅在個(gè)別區(qū)間的上皮細(xì)胞間仍存在有裂隙，少數(shù)胞核的分布仍略微雜亂胞核形態(tài)已大部分得到恢復(fù)(圖1-5)。300min組管壁形態(tài)較為完整，但由于細(xì)胞高度恢復(fù)不一而使腔面呈凹凸?fàn)睿巳杂腥笔Ш蜕y的現(xiàn)象(圖1-6)。450min組僅處于腎臟外圍的近曲小管管壁仍有局部的斷裂現(xiàn)象，大部分基本恢復(fù)，胞核形態(tài)和分布也趨于正常(圖1-7)。各組近曲小管的基膜結(jié)構(gòu)在恢復(fù)15d后都已接近完整，僅局部存在裂隙。對(duì)近曲小管的PAS染色所示，隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，近曲小管上皮細(xì)胞游離面陽(yáng)性染色的面積增大充滿管腔，也呈現(xiàn)向胞質(zhì)內(nèi)部擴(kuò)散的趨勢(shì)。但300min組恢復(fù)12d時(shí)，不僅陽(yáng)性區(qū)域明顯減小，且靠近游離面邊緣的染色明顯變深(圖1-15)

。

遠(yuǎn)曲小管在恢復(fù)期中，150min組在3d后，部分遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞之間界限變得清晰，胞核分布趨于正常;12d時(shí)管壁細(xì)胞基膜基本恢復(fù)完整;15d時(shí)遠(yuǎn)曲小管管壁組織學(xué)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常(圖1-5)。300min組是損傷程度最嚴(yán)重的一組，在經(jīng)歷了15d恢復(fù)后，上皮細(xì)胞基膜局部仍有斷裂，部分細(xì)胞間裂隙仍存在，胞核也沒(méi)有恢復(fù)正常大小，且還有大量的形態(tài)異常胞核(圖1-6)。450min照射組恢復(fù)程度介于150與300min照射組之間，在15d時(shí)僅有少數(shù)核缺失與移位現(xiàn)象存在，管壁細(xì)胞基膜與管壁結(jié)構(gòu)已趨于正常(圖1-7)。