本文作者：張路遙 牛婉婷 楊昊 潘敏 單位：浙江大學生物醫學工程

量子點(quantumdots,QDs)是一種熒光半導體納米晶體,直徑1~100nm。量子點主要由Ⅱ~Ⅵ族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ~Ⅳ族元素(如InP、InAs等)組成,目前生物醫學領域研究常用的水溶性量子點主要是CdX(X=S、Se、Te)[1]。由于量子限域效應量子點具有獨特的光學特性:耐光漂白、激發光譜寬、發射光譜窄且隨粒徑大小的改變而改變。所以,不同粒徑的量子點可以在同一激發光的激發下發射不同顏色的熒光,有望解決傳統染料在復色檢測中存在的光譜覆蓋、不能同時激發等問題。1996年,Alivisatos[2]解決了量子點作為生物探針與生物分子之間的相容性問題,實現了量子點在生物領域的應用。1998年,Chan等[3]實驗證明量子點作為熒光標記物有傳統熒光染料20倍的亮度、100倍的抗光漂白能力、1/3的發射半峰寬,從此,量子點成了最有前途的熒光標記物之一。經過修飾的水溶性量子點,表面可與多種生物分子結合,從而獲得功能基團;基于量子點的探針和檢測系統可廣泛應用于生物醫學檢測系統中;量子點的表面敏感特性在檢驗中也得到了應用[4,5];在熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術中量子點作為供體也顯示了傳統熒光染料所沒有的優點;量子點在各種新技術中的應用更顯示了其巨大的潛力。本文將全面綜述經過修飾的量子點在各方面的應用現狀。

1量子點探針的應用

經過修飾的水溶性量子點具有免疫活性[3]和高度的特異性[6],可以作為熒光探針應用于熒光免疫分析。偶聯了抗體的量子點探針可用于檢測抗原或細菌、腫瘤等有表面抗原的病原體、細胞、組織,并且具有很高的靈敏度。另外,量子點對表面變化非常敏感,基于量子點的這一特性發展起來的熒光猝滅探針、酶活性探針也具有很好的實用價值。

1.1量子點熒光免疫探針用于抗原檢測

Azzazy等[7]用親和素量子點探針對生物素化的前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen,PSA)進行了檢測,檢測限低達0.38pg/ml。Ker-man等[8]改進了探針制備技術,將量子點與單克隆抗體通過親和素-生物素偶聯制成探針,從而可以利用雙抗夾心免疫法直接對人血清標本中的PSA進行檢測,其檢測限可達0.25ng/ml,線性范圍為0•25~100ng/ml。

1.2量子點熒光免疫探針用于細菌檢測

Hahn等[9]報道了一種用量子點免疫探針檢測大腸桿菌O157∶H7的檢測技術。他們用鏈霉親和素修飾的CdSe/ZnS核殼式量子點和生物素化的抗體偶聯,這種探針可以特異性地識別大腸桿菌O157∶H7,檢測限達2•08×107cfu/ml,比傳統異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)靈敏度更高、穩定性更好。Yang等[10]利用不同顏色的量子點同時檢測了兩種病原菌:大腸桿菌O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Typhimurium。發射波長分別為525nm和705nm的兩種量子點分別偶聯大腸桿菌O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Typhimurium的抗體。該方法能特異性識別并定量檢測混合體中相應的細菌,檢測限為1×104cfu/ml。

1.3量子點熒光免疫探針用于腫瘤檢測

Hu等[11]用PEG修飾的CdSe量子點實現了細胞表面腫瘤標記物-癌胚抗原(carcinoembryonican-tigen,CEA)的檢測。PEG量子點通過靜電吸附偶聯CEA抗體rch24。這種探針能比傳統的FITC標記更有效地檢測LS180細胞系表面表達的CEA。Yu等[12]用CdSe/ZnS量子點偶聯鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)抗體來識別肝癌標記物AFP,量子點-AFP抗體探針通過尾靜脈注射到小鼠內。點對點激光照射獲取腫瘤部位和正常組織的熒光信號:熒光主要分布在肝癌組織上,周圍組織的熒光強度迅速下降,基本無非特異性分布。

1.4量子點熒光探針猝滅的應用

量子點表面修飾有生物活性的酶之后,基于量子點對表面敏感的特性,可以用于檢測酶底物的濃度。Ji等[13]報道了一種新穎的基于CdSe/ZnS量子點-有機磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)探針的生物傳感器。其熒光猝滅程度和有機磷的濃度成線性相關,檢測限可達10-8mol/L。增大OPH和量子點的比例能夠增加傳感器的靈敏度,但是當量子點表面結合的OPH已經飽和后,探針靈敏度不再增加。該方法為有機磷的檢測提供了新途徑,極具實用價值。

2量子點FRET在檢測中的應用

FRET是一項應用能量轉移來測量分子級別的距離的技術。當供體發射的熒光與受體的吸收光譜重疊,并且供受體之間的距離很近(<10nm)時,供體受激發產生的偶極子震蕩就會引起受體偶極子的共振,發生這種非放射性的能量轉移[14]。FRET對供受體間的距離非常敏感[15],可以用來檢測蛋白質、核酸的分子結構和距離的微小變化。量子點作為FRET供體相對于有機熒光染料在靈敏度方面有很大的優勢:量子點的激發光譜寬,可以選擇產生背景熒光少的激發波長段來進行檢測,量子點-有機染料-FRET探針可產生相對背景熒光更顯著的熒光信號,從而能夠檢測到較低濃度的目標,并且多余的探針并不影響檢測效果,操作起來更為方便。

2.1量子點FRET在DNA檢測中的應用

基于量子點檢測DNA的方法很多,大部分量子點DNA探針是用量子點作為供體、有機染料作為受體的。Zhang等[16]介紹了一種超靈敏的、基于量子點熒光共振轉移的DNA檢測方法。該方法可以用于檢測未分離的低濃度DNA。量子點修飾一段DNA單鏈,有機染料Cy5標記另一段DNA單鏈,Cy5作為受體,量子點作為供體,二者與目標DNA結合,從而發生FRET。與同樣用FRET技術的分子信標法相比,量子點作為供體背景熒光更少,靈敏度更高(4•8fmol/L),目前已成功檢測基因點突變。

2.2量子點FRET在蛋白濃度和酶活性檢測中的應用

Ma等[17]發現FRET可以用于檢測溶液中鼠源IgG的含量。紅綠兩種不同顏色的量子點先后加入到IgG溶液中與IgG通過靜電結合后可以觀測到FRET現象的發生。FRET增強的程度和IgG濃度成線性相關,線性范圍在0•1~20•0mg/L。在此FRET體系中加入木瓜蛋白酶后,IgG酶解,兩種量子點之間的距離增大,FRET也隨之消失。從另一個角度考慮,FRET也可以用于酶的活性檢測。基于這一原理,Xu等[18]將Cy5-底物-量子點FRET探針用于β-內酰胺酶的活性的檢驗,檢測限32μg/ml。這種酶是細菌產生的,其活性與細菌的抗藥性相關,在檢驗β-內酰胺類抗生素藥效方面具有很重要的臨床意義。

3量子點在新技術中的應用