作者：王特樟 李宏吉 郭靜璇 王彥波 單位：浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院海洋資源與營養(yǎng)生物學(xué)研究中心

現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)之一，在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定、定量和結(jié)構(gòu)分析方面起著非常重要的作用。質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和序列測定的基本原理是使用電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光解吸離子化的軟電離方法，經(jīng)酶切后的蛋白質(zhì)肽段或完整蛋白質(zhì)帶上電荷，然后根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比的差異來分離并確定相對(duì)質(zhì)量。樣品分子進(jìn)行上述方法電離時(shí)能保留整個(gè)分子，確保了完整性而不會(huì)形成碎片離子，稱為肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）技術(shù)。PMF是一種現(xiàn)在運(yùn)用最廣的用來鑒定2-DE分離出來的蛋白質(zhì)和肽的方法，伴隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用將越來越廣泛。

高效液相色譜及多維液相色譜高效液相色譜（HPLC）技術(shù)最初被用于分離蛋白質(zhì)或多肽。現(xiàn)在，HPLC已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，它是基于樣品分子在固定相（柱填料）和流動(dòng)相（淋洗液）間的特殊相互作用而實(shí)現(xiàn)樣品分離的。無須變性處理樣品，可實(shí)現(xiàn)上樣收集及在線分析的自動(dòng)化。利用液相色譜結(jié)合電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）而不依賴于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特異性的胰蛋白酶消化，產(chǎn)生的多肽由強(qiáng)陽離子交換柱和反相HPLC分離后經(jīng)ESI-MS/MS分析。液相色譜與MS聯(lián)用，采用高速且高靈敏度的色譜分離法來代替耗時(shí)的2-DE蛋白質(zhì)分離法，故其與經(jīng)典的2-DE-MS法相比，具有快速、樣品需要量少和多肽分離的通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更進(jìn)一步的應(yīng)用。但由于層析填充物對(duì)許多蛋白質(zhì)組分有吸附作用，且難以實(shí)現(xiàn)多組分蛋白質(zhì)樣品的多維層析，因此僅適用于研究單一蛋白質(zhì)或簡單樣品蛋白質(zhì)組。多維液相色譜（MLC）則是利用與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，可以檢測低豐度肽段，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究最新的技術(shù)，可快速并高通量鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在畜禽動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)中的飼養(yǎng)管理、飼料結(jié)構(gòu)、飼喂方式和飼養(yǎng)密度在基于動(dòng)物營養(yǎng)和飼料工業(yè)的現(xiàn)代肉類生產(chǎn)的出現(xiàn)后，發(fā)生了本質(zhì)性的改變。同時(shí)，大規(guī)模的現(xiàn)代肉類生產(chǎn)影響到了飼養(yǎng)動(dòng)物的生理學(xué)、行為學(xué)和生物化學(xué)過程，隨之導(dǎo)致了肉品品質(zhì)的下降。同時(shí)生產(chǎn)者為了增大產(chǎn)量和減少疾病風(fēng)險(xiǎn)，在養(yǎng)殖過程中濫用抗生素等化學(xué)藥物，加劇了肉類品質(zhì)的惡化。此外，為了追求提高肉類的某些性能，忽視了飼養(yǎng)動(dòng)物的體質(zhì)健康、外部形狀與內(nèi)在機(jī)能的協(xié)調(diào)，生理學(xué)的平衡和整體適應(yīng)性，從而導(dǎo)致現(xiàn)代肉用動(dòng)物（豬和雞）對(duì)周圍環(huán)境條件的高度敏感性，最終導(dǎo)致了肉品的食用品質(zhì)，如：色澤、風(fēng)味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素殘留現(xiàn)象極為突出。鑒于此，對(duì)肉品品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)并對(duì)其進(jìn)行可能的等級(jí)標(biāo)注及對(duì)其生產(chǎn)過程控制，對(duì)于現(xiàn)代肉品生產(chǎn)至關(guān)重要。蛋白質(zhì)是肌肉組織的重要組成成分，研究表明：肉類品質(zhì)研究與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究間密不可分，蛋白組變化可能與肉的嫩度相關(guān)。肌纖維分紅肌纖維和白肌纖維2種類型，這2種類型在代謝水平上存在著結(jié)構(gòu)和功能的差異。纖維類型與肉質(zhì)性狀，如：多汁性、風(fēng)味和嫩度等的關(guān)系存在著很多爭議，尤其是纖維類型對(duì)肉嫩度的影響仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白質(zhì)組樣品，這些肌肉蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量介于5000~20萬不等，pH在4~9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了15種顯著的變化。此后的研究中Lametsch等最終確定了可作為肉品質(zhì)標(biāo)記的20多種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白）和代謝酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在這些標(biāo)記蛋白中，人們發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈與肌肉的剪切力間存在極顯著的相關(guān)，這就清楚地表明屠宰后肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈的降解會(huì)影響肉的質(zhì)量。Remignon等直接對(duì)肌肉蛋白質(zhì)片段進(jìn)行分析，認(rèn)為蛋白質(zhì)的改變很可能是導(dǎo)致家禽PSE肉綜合征的直接原因。Molette等研究發(fā)現(xiàn)火雞屠宰后胸肌糖酵解的速度比較快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），從而使得肉品質(zhì)發(fā)生改變，如：系水力下降、加工產(chǎn)量降低和嫩度降低等。同樣報(bào)道了糖酵解快的動(dòng)物肉的系水力低，并且提取到的肌漿蛋白含量低，這表明當(dāng)pH下降的速率加快時(shí)蛋白質(zhì)功能發(fā)生了改變。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)特別是魚的品質(zhì)鑒定中已有應(yīng)用，目前也被廣泛應(yīng)用到了對(duì)蝦和海蜇等的品質(zhì)控制中。隨著對(duì)魚類水產(chǎn)品的需求日益增長，保障和控制其安全生產(chǎn)具有重要的意義。在以數(shù)量增長為主的水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖、運(yùn)輸和銷售過程中，擁擠應(yīng)激是常見的影響水產(chǎn)品食用品質(zhì)的因素，解凍程序同樣深刻地影響水產(chǎn)的品質(zhì)。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛地應(yīng)用到了水產(chǎn)品品質(zhì)控制。Inger等利用2-DE技術(shù)研究新鮮的鱈魚與死后鱈魚肌肉，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生了變化，其中8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度顯著增加，后續(xù)分析表明：這些蛋白質(zhì)點(diǎn)是肌原蛋白、肌漿蛋白和肌肉纖維等肌肉組織的分解產(chǎn)物。由此可見，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)評(píng)價(jià)魚肉鮮度等品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Kjaersgard等通過對(duì)11種不同冷凍儲(chǔ)存條件下對(duì)鱈魚肌肉蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)不同冷凍儲(chǔ)存溫度對(duì)蛋白質(zhì)圖譜并無顯著影響，但經(jīng)過不同的冷凍儲(chǔ)存時(shí)間（3、6和12個(gè)月），肌漿球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A和2-α肌動(dòng)蛋白片段等蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了顯著變化，從而導(dǎo)致魚肉的質(zhì)地和味道發(fā)生了變化。Martinez等通過研究人工養(yǎng)殖的鱈魚與野生的鱈魚，比較發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖的鱈魚2-DE圖上蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在3.5萬~4.5萬間存在顯著差異。然而目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖和貯藏加工過程中的研究還處于起步階段，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，將在水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)中起到更加重要的作用。

前景展望

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方法不同，它著眼于一個(gè)機(jī)體或一個(gè)細(xì)胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的活動(dòng)來揭示生命活動(dòng)的規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用目前取得了一定的進(jìn)展，但是仍處在起步階段。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)和相關(guān)理論的發(fā)展，畜禽和水產(chǎn)等動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)的研究已經(jīng)到了分子細(xì)胞水平，動(dòng)物性產(chǎn)品的質(zhì)量安全很大程度上也依賴于現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用，及時(shí)全面了解和掌握蛋白質(zhì)等分子的理論和技術(shù)動(dòng)態(tài)，將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明：動(dòng)物機(jī)體的生理病理等變化，如：生長發(fā)育、新陳代謝、免疫疾病和消化吸收等，就本質(zhì)而言，與動(dòng)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能是分不開的。鑒于此，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)相關(guān)研究與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從分子水平闡述各種營養(yǎng)素的作用機(jī)制是現(xiàn)代動(dòng)物營養(yǎng)今后發(fā)展的熱點(diǎn)之一。隨著研究的不斷深入，操作更加簡便、重復(fù)性更好的蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)和新方法必將在動(dòng)物營養(yǎng)及相關(guān)動(dòng)物性食品安全生產(chǎn)中扮演舉足輕重的角色。