目前對采用人工接種發酵生產桑葉茶及其對其中DNJ、黃酮、多糖、多酚等主要功能成分含量影響的研究鮮有報道。本文分別以4種菌單獨或組合發酵桑葉制得的桑葉茶，分析其中DNJ、黃酮、多糖、多酚4種功能成分含量變化，為桑葉的深度開發利用提供數據。

材料與方法

1.實驗材料

1）實驗菌種：黑曲霉(AsPergillusniger)，GSICC60108，甘肅省微生物菌種保藏中心；日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)，GIM3.119，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；綠色木霉(Trichodermaviride)，GIM3.443，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；青霉(Penicillium)，GSICC61603，甘肅省微生物菌種保藏中心。以上四種菌種的安全等級均高，其生物危害程度為四類，在通常情況下不會引起人類或者動物疾病。

2）實驗樣本：自然發酵桑葉茶、人工發酵桑葉茶由本實驗室自制。

2.試劑與儀器

1）主要試劑：DNJ標準品，北京德威鈉生物技術有限公司；甘氨酸（Gly），sigma公司；9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl），sigma公司；乙腈為色譜純，天津市四友精細化學品有限公司；沒食子酸標準品，中國藥品生物制品檢定所；蘆丁標準品，北京德威鈉生物技術有限公司；其他常用試劑均為分析純。

2）主要實驗儀器：Waters1525HPLC，美國Waters公司；5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；Spectrumlab22可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

3.實驗方法

1）發酵桑葉茶的制備：采摘從頂芽往下數4-10片的新鮮桑葉，去柄，切為4cm×4cm的小葉片，混勻后稱取100g葉片用微波殺青90s，揉捻，加入107cfu菌液10mL(自然發酵只加10mL無菌水)，復揉，28℃發酵5h，微波干燥，制得桑葉茶。（注：加菌量共為107cfu，菌種復配比例為1:1或1:1:1。）2）DNJ的測定測試樣品的制備：取桑葉茶粉末0.5g，加入一定量超純水，80℃水浴浸提2h(每20min搖勻一次)，抽濾后，濾渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超純水定容至50mL，即得樣品提取液。DNJ的衍生化及測定方法按照參考文獻[19]進行。色譜條件：色譜柱：C18柱（150mm×4.6×5μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量10μL；紫外檢測器，檢測波長254nm。3）黃酮測定：取桑葉茶粉末0.5g于50mL離心管中，加70%乙醇15mL，80℃水浴80%功率超聲提取15min，7000r/min離心5min，抽濾，得到濾液。如此共提取3次，濾液用70%的乙醇定容至50mL。吸取1.0mL濾液，用AlCl3比色法[20]測定4）多糖測定：取桑葉茶粉末0.250g于蘭蓋瓶中，加入20mL沸蒸餾水，在100%功率下55℃超聲提取20min，將提取液過濾后定容至25mL。取1.0mL濾液用苯酚-硫酸法[21]測定多糖含量。5）多酚測定：按照GB/T8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[22]進行測定。

4.數據統計與分析：各實驗至少重復3次以上，實驗數據用Excel和Spss16進行統計處理。

結果和討論

1.各活性成分標準曲線線性回歸方程及相關系數

按照3.2）的實驗方法，對不同濃度DNJ標準溶液進行測定，得到DNJ的標準曲線線性回歸方程為y=15776x-70392，相關系數r=0.9996。式中x為DNJ濃度，μg/mL；y為峰面積。按照1.3.3實驗方法，測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，得到蘆丁標準曲線線性回歸方程為y=11.622x-0.0031，相關系數r=0.9997。式中，x為蘆丁濃度，μg/mL；y為吸光度。按照1.3.4的實驗方法，測定不同濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，得到葡萄糖的標準曲線線性回歸方程為y=10.909x-0.0021，相關系數r=0.9998。式中，x為葡糖糖的濃度，μg/mL；y為吸光度。按照1.3.5的實驗方法，測定不同濃度沒食子酸標準溶液的吸光度，得到沒食子酸的標準曲線線性回歸方程為y=0.0208x+0.0034，相關系數r=0.9998。式中，x為沒食子酸的濃度，μg/mL；y為吸光度。實驗結果表明，各標準曲線的相關系數均大于0.9990，線性關系良好，可用于樣品中相關活性成分的測定。

2.DNJ標準品和樣品的色譜圖

將DNJ經衍生化后上高效液相色譜儀進行測定，得到如圖1、圖2、圖3所示色譜圖：由色譜圖2可知，在本實驗條件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留時間為2.731min，與Gly-FMOC和FMOC-OH的峰間距分別相差2.719min和4.243min，表明這兩種物質均不干擾DNJ的測定。

3.單一菌種發酵桑葉茶中DNJ等活性成分含量變化

分別以黑曲霉、日本根霉、綠色木霉和青霉的單一接種于桑葉中進行發酵生產桑葉茶，與自然發酵生產的桑葉茶比較其DNJ等活性成分含量的變化。實驗結果如表1：從表1可知，用綠色木霉發酵所得桑葉茶中DNJ含量為111.28mg/100g.干重，與自然發酵得到的桑葉茶比較，下降了6.43%，且有顯著性差異（P＜0.05）；而日本根酶、黑曲霉、?霉發酵后得到的桑葉茶中DNJ含量均上升，特別是日本根酶發酵后DNJ含量為131.56mg/100g.干重，與自然發酵的桑葉茶比較增加10.63%，具有極顯著差異（P＜0.01）。與自然發酵比較，4種單一菌種發酵桑葉茶中多糖含量均下降，其中黑曲霉、青霉、綠色木霉發酵的桑葉茶中多糖含量與自然發酵的比較分別下降了14.48%、8.84%、9.18%，均具有極顯著性差異（P＜0.01）；而日本根霉發酵桑葉茶中多糖僅下降了2.67%，無顯著性差異（P＞0.05）。與自然發酵比較，用日本根霉發酵桑葉茶中黃酮增加了5.78%，有極顯著性差異（P＜0.01）；而黑曲霉、青霉、綠色木霉3種菌發酵桑葉茶中黃酮含量分別降低了23.77%、0.86%、14.73%，其中黑曲霉、綠色木霉發酵的桑葉茶中黃酮下降有極顯著差異（P＜0.01）；而?霉發酵后黃酮含量下降無顯著性差異（P＞0.05）。與自然發酵比較，用日本根霉、黑曲霉、青霉、綠色木霉發酵桑葉茶中的多酚含量分別降低了9.00%、33.56%、11.74%、24.56%，其中日本根霉發酵桑葉茶中多酚含量下降相對較少，但也有顯著性差異（P＜0.05），而黑曲霉、青霉、綠色木霉發酵的桑葉茶中多酚含量下降有極顯著性差異（P＜0.01）。綜合單一菌種發酵實驗的結果可知，與自然發酵比較，采用日本根霉發酵后所得桑葉茶中DNJ、黃酮含量有極顯著增加；而多糖、多酚含量雖然有所下降，但比實驗的其他菌種發酵后桑葉茶中這兩種成分的下降低很多。因此，從對發酵桑葉茶功能成分影響來看，單一菌種發酵以日本根酶較好。