材料與方法

1.材料與試劑:

新西蘭無水奶油(上海愛普香精香料有限公司)；Palatase20,000L（丹麥諾維信公司）；0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(食品級)；0.1mol/L氫氧化鉀標準溶液（分析純）；95%乙醇（分析純）；石油醚（分析純）；酚酞；氫氧化鈉-乙醇溶液（分析純）；0.5mol/L鹽酸標準溶液（分析純）；中性乙醇（自制）；去離子水（自制）。

2.儀器與設備:ZNHW-Ⅱ型智能恒溫電熱套，鞏義市予華儀器有限責任公司；PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JB90-SH型數顯恒速強力電動攪拌機，上海標本模型廠；DHG-9073B5-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；智能數顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司。

3.試驗方法

原料奶油基本成分分析方法:脂肪含量的測定：酸水解法GB5009.6-2003；蛋白含量的測定：微量凱氏定氮法GB5511-2008；水分的測定：干燥法GB5497-1985；灰分的測定：馬福爐灼燒法GB5009.4-2010；過氧化值的測定：碘量法GB5538-2005；酸價的測定：滴定法GB5530-2005。

酶解產物的制備及處理:取150g無水奶油于0.2mol/L磷酸緩沖液中，將此混合物置于三角瓶中，加入0.25%的酶在50℃、以170r/min攪拌下進行酶解反應，分別在2小時、4小時、6小時、8小時、10小時取適量的反應物測定其酸價和皂化價，以脂解率為評價指標，在各個不同反應階段，研究不同的酶添加量、底物濃度、酶解時間及pH對酶解產物的影響。

脂解率的測定:測定酶解反應混合物前后的酸值（AV）和皂化值（SV），根據公式（1-1）來計算脂解率：脂解率%=反應前后酸價變化含量/反應后的皂化值×100（1-1）式中：皂化值的測定[17]：約稱量2g酶解產物加入到25ml氫氧化鈉-乙醇溶液于錐形瓶中，接上回流冷凝管，在恒溫85℃的水浴鍋中煮沸約30分鐘，待煮液透明后，取下回流冷凝管加入中性乙醇溶液10ml。向錐形瓶中滴加酚酞數滴，趁熱用鹽酸滴定紅色消失。

4.奶油酶解工藝條件優化

單因素實驗結果表明，當加酶量為底物干重的0.25%時與0.3%時基本保持水平，這時的脂解率不再隨加酶量的增加而增加，同時考慮到生產工業化的成本，因此選擇底物干重的0.25%作為酶添加量。同時隨著酶解時間的增長，脂解率也會不斷的增大，但酶解的目的不在追求脂解率的最大化，而在于能得到風味最佳的酶解基料，同時在單因素反應系列中不難發現，酶解反應到最后幾個小時，脂解率基本保持一致，不再隨反應時間增長而增大。此外，若酶解時間過長會導致長鏈脂肪酸釋放過多，以至于基料帶有明顯的皂味；若酶解時間過短必會影響到中短鏈脂肪酸的釋放，導致基料風味有缺陷，增香強度不夠[18]，所以初步選定酶解時間為6小時，以底物濃度、酶解溫度和pH值3個因素作為自變量，并以單因素試驗結果為依據，以脂解率為響應值，利用Design-Expert7.0設計三因素三水平試驗方案，建立二次回歸方程擬合因素和響應值之間的函數關系，采用響應面分析法來確定最佳的酶解條件。

結果與討論

1.原料奶油基本成分:酶法制備奶味香精基料可以選擇多種原料，不同奶油原料有著不同的風味特點，為制得氣味自然，滋味濃厚感突出的增香產物，除了乳脂肪外還需要適量能溶于水的小分子乳蛋白呈味物質。原料奶油基本成分見表1。

2.單因素試驗結果

酶添加量對脂解率影響:在反應體系總量150g不變的條件下，固定奶油底物和緩沖液的相對質量比為85%，反應溫度為50℃，pH為8，分別考察不同酶添加量（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）對脂解率的影響，并且分別在2小時、4小時、6小時、8小時和10小時取樣分析不同酶解時間對整個反應的影響。結果如圖1所示。圖1結果表明，隨著加酶量的增加，脂肪酶Palatase20,000L對無水奶油的酶解作用逐漸增強，當加酶量超過0.25%底物干重時，脂解率增加趨勢變緩，說明酶已經達到飽和濃度，而且反應在6-10小時這個間段與0.3%底物干重時反應體系幾乎重疊，說明當反應時間大于6小時，脂解率變化不明顯，繼續增加酶濃度及反應時間對酶解率的影響不大，所以選擇最適酶添加量為0.25%底物干重。

底物濃度對脂解率的影響:脂肪酶在油水界面上具有較大的活性，因此催化作用需要有一定的水分來維持酶分子的活性構象，同時改變其分子構象暴露活性中心，使酶處于激活狀態而表現一定的催化能力。當水分含量過低或過高時，酶分子的催化部位就不能和水分子緊密接觸，進而不能很好的維持酶的活性分子構象，導致酶解能力降低[19]，因此，油脂水解需要一個適宜的底物濃度，為此本實驗在保持反應總量不變的條件下，改變無水奶油與磷酸鹽緩沖液的相對質量比來觀察底物濃度對脂解率的影響，分別選擇75%、80%、85%、90%、95%五個底物濃度，并且在不同時間段分析酶解時間對脂解率的影響，結果如圖2所示。由圖2可見，底物濃度對脂解率影響是明顯的，在濃度處于75%到85%之間時脂解率迅速增大，而當底物濃度超過85%后脂解變化開始變緩，從90%上升到95%時脂解率反而呈減少趨勢，由于脂肪酶活性僅需少量水就可以保持酶的活性，因此只要能夠滿足酶的活性，脂解率就會隨底物濃度增大而增大，若底物濃度過大，則會產生底物對酶解反應有抑制作用，因此水解乳脂肪的最適底物濃度為85%。

pH對脂解率的影響:不同的pH值會影響到酶分子活性中心的催化基團的穩定性，進而影響整個反應體系的酶解速率，在固定酶添加量、底物濃度、溫度及不同反應時間段，調節磷酸鹽緩沖液的pH值來觀察不同pH值對脂解率的影響，結果如圖3所示。圖3結果表明，在相同的實驗條件下，當pH為8時，奶油酶解的速率是最高的，在各個不用的時間段也是在pH為8時最高，因此脂肪酶Palatase20,000L在pH為8時酶解活性最強，為此最適反應pH為8。

溫度對脂解率的影響：不同的溫度會影響到脂肪酶活性中心的分子構象分布及底物奶油的乳化狀態，進而影響到整個反應的酶解速率，在溫度低于最適溫度時，酶活性較低，則反應速度較慢；當溫度高于最適溫度時會導致脂肪酶變性而減弱甚至失去催化活性，本試驗選擇5個溫度條件，固定底物濃度、酶添加量及pH值在不同時間點分別取樣來分析不同溫度對脂解率的影響。結果如圖4所示。從圖中可以看出溫度對脂肪酶Palatase20,000L影響是很明顯的，當溫度從40℃升高到50℃時脂解率是明顯增大，而溫度升高到50℃后脂解率就出現變緩趨勢，處于50℃與55℃之間時達到最大值，但當繼續升高溫度時脂解率是明顯下降，說明脂肪酶已逐步變性失活，同時隨著反應時間的延長底物量不斷減少，酶活力的下降，從反應6小時后，脂解率的增加已趨于平緩，在6、8、10小時這時間段反應速率曲線趨于重疊。因此脂肪酶Palatase20,000L的最適酶解溫度在50℃左右。