表達(dá)透明顫菌血紅蛋白對(duì)圓紅冬孢酵母油脂積累的影響

　　摘要：產(chǎn)油酵母的油脂合成是高度耗氧的生物過(guò)程，為提高油脂合成過(guò)程中細(xì)胞利用氧氣的能力，將透明顫菌的血紅蛋白基因vgb整合到油脂高產(chǎn)菌株圓紅冬孢酵母的染色體中。首先構(gòu)建了透明顫菌血紅蛋白基因vgb表達(dá)載體pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化至R.toruloidesNP11中，獲得重組菌株。Westernblot和CO差異光譜分析表明，透明顫菌血紅蛋白在R.toruloidesNP11中成功表達(dá)并且具有生物活性。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明：與出發(fā)菌株相比，在氧氣充足條件下，重組菌株NG-21的油脂產(chǎn)量提高了18%;在氧氣不足條件下，重組菌株NG-22的油脂產(chǎn)量提高了28%;在限氧和不限氧的條件下，透明顫菌血紅蛋白均能夠促進(jìn)圓紅冬孢酵母的油脂積累。

　　本文源自可再生能源,2020,38(09):1143-1148.’《可再生能源》雜志，于1983年經(jīng)國(guó)家新聞出版總署批準(zhǔn)正式創(chuàng)刊，CN:21-1469/TK，本刊在國(guó)內(nèi)外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時(shí)效性強(qiáng)的特點(diǎn)，其中主要欄目有：政策與管理 、研究與實(shí)驗(yàn) 、實(shí)用技術(shù)等。

　　化石燃料的日益耗竭和環(huán)境問(wèn)題的日益凸顯，使得人們將目光投向綠色可再生能源。作為生物柴油的原料之一，微生物油脂具有生產(chǎn)周期短、底物來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，因而受到研究者的廣泛關(guān)注。自然界中，少數(shù)微生物可在細(xì)胞內(nèi)合成并儲(chǔ)存超過(guò)自身細(xì)胞干重20%以上的油脂，這些微生物被稱為“產(chǎn)油微生物”[1]。圓紅冬孢酵母屬于紅酵母屬，其油脂積累可達(dá)細(xì)胞干重的60%以上，同時(shí)，其可以利用的底物較為廣泛，木糖、甘油、木質(zhì)纖維素等廉價(jià)的原料均可被其用于油脂發(fā)酵[2,3,4]。

　　透明顫菌是一種專性好氧原核生物，其胞內(nèi)表達(dá)的血紅蛋白(VHb)使其在貧氧的環(huán)境下依然能夠生存。透明顫菌血紅蛋白與氧氣的結(jié)合速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其與氧氣的解離速率，因此，透明顫菌能夠在胞內(nèi)儲(chǔ)存更多的氧氣[5]。胞內(nèi)儲(chǔ)存的氧氣可以加速胞內(nèi)氧化磷酸化的效率;影響細(xì)菌胞內(nèi)的Fnr,OxyR轉(zhuǎn)錄因子，從而提高胞內(nèi)透明質(zhì)酸、β-葡萄糖苷酶等異源蛋白的表達(dá)量;參與胞內(nèi)的代謝途徑，增加胞內(nèi)代謝物的產(chǎn)量[6,7,8,9,10]。

　　微生物油脂發(fā)酵后期，細(xì)胞密度增大，導(dǎo)致溶氧量不足，使得細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，胞內(nèi)產(chǎn)物不能正常積累。提高溶氧的傳統(tǒng)方法有增加攪拌速率和增大通氣量，但是，這兩種方法均會(huì)增加機(jī)械力從而對(duì)細(xì)胞具有一定損傷。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)緩解氧氣供給不足的情況是一種行之有效的替代方法。XueSJ研究了透明顫菌血紅蛋白對(duì)菌中普魯蘭產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明，普魯蘭的產(chǎn)量從72.0g/L增加至102.3g/L[11]。ZhangH的研究表明，在溶氧量為30%的3L發(fā)酵罐中，與出發(fā)菌株相比，表達(dá)vgb基因的重組菌株Yarrowialipolytica的生物量增加了27%，油脂含量增加了38.69%[12]。

　　本文嘗試通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，將透明顫菌的血紅蛋白基因vgb整合至圓紅冬孢酵母中，并考察重組菌株在氧氣溶量不同的發(fā)酵條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累情況，為微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

　　1、材料和方法

　　1.1菌株和質(zhì)粒

　　本實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒的信息如表1所示。

　　表1所用菌株和質(zhì)粒

　　1.2工具酶和試劑

　　PrimeSTARDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DpnI等均購(gòu)自大連TaKaRa公司;DNAMarker2KplusII購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒快速提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和其他生物試劑均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司，測(cè)序工作委托蘇州泓汛公司完成;其他試劑均為分析純?cè)噭１狙芯克玫囊锶绫?所示。

　　表2本研究所用的引物

　　1.3培養(yǎng)基

　　LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L和氯化鈉10.0g/L,pH值為7.0。

　　LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂粉15.0g/L。

　　YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L、酵母提取物10.0g/L和蛋白胨20.0g/L,pH值為6.0。

　　YPD固體培養(yǎng)基：在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂粉15.0g/L。

　　氮源限制培養(yǎng)基(NL培養(yǎng)基)：葡萄糖70g/L、硫酸銨0.1g/L、酵母提取物0.75g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、結(jié)晶硫酸鎂1.5g/L、體積分?jǐn)?shù)為1%的痕量元素儲(chǔ)液(結(jié)晶氯化鈣4.0g/L、結(jié)晶硫酸亞鐵0.55g/L、一水合檸檬酸0.52g/L、結(jié)晶硫酸鋅0.1g/L、結(jié)晶硫酸錳0.076g/L和100μL18M的濃硫酸)，pH值為6.0。

　　MM鹽溶液：磷酸氫二鉀2.05g/L、磷酸二氫鉀1.45g/L、氯化鈉0.15g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.066g/L、七水硫酸鐵0.00248g/L和硫酸銨0.5g/L,pH值為7.0。

　　IM誘導(dǎo)平板：MM鹽溶液400mL、甘油5mL、去離子水540mL、瓊脂粉20g，高壓滅菌后加入40mL1M的MES和最終濃度為200μM的乙酰丁香酮(以上為配置1L時(shí)的添加量)。培養(yǎng)微生物的過(guò)程中，可根據(jù)需求添加適量的抗生素。

　　1.4載體構(gòu)建

　　設(shè)計(jì)含有NcoI和SpeI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的引物NcoI-F和Ble-P2A-VHb-R，擴(kuò)增pUC57-vgb得到NcoI-vgb-SpeI片段;將質(zhì)粒pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-mcs-THSP與該片段同時(shí)進(jìn)行NcoI和SpeI雙位點(diǎn)酶切，再連接;通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，在含有50μg/mL的Kan的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子并測(cè)序，獲得重組載體pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP。

　　1.5重組菌株的構(gòu)建

　　將測(cè)序正確的pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgbTHSP載體電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細(xì)胞中，并在含有50μg/mL的Kan的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取基因型正確的重組農(nóng)桿菌單克隆轉(zhuǎn)接于5mLLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL的Kan)中。同時(shí)，挑取圓紅冬孢酵母NP11接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中，兩種菌株均在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)16h。取一定量的菌液于1.5mL離心管中，于13000r/min離心30s，收集菌體，用無(wú)菌蒸餾水洗滌1次。用無(wú)菌蒸餾水將菌稀釋至OD600=0.6，分別吸取100μL稀釋好的農(nóng)桿菌和酵母菌等量混合，涂布于IM平板濾紙載面上，并放于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，將濾紙轉(zhuǎn)至潮霉素抗性濃度為50μg/mL的YPD平板進(jìn)行重組菌株的篩選，長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證及基因型驗(yàn)證。

　　1.6VHb表達(dá)及功能驗(yàn)證

　　分別在平板上挑取出發(fā)菌株R.toruloidesNP11(簡(jiǎn)記為NP11)與重組菌R.toruloidesNG-20,R.toruloidesNG-21和R.toruloidesNG-22(分別簡(jiǎn)記為NG-20,NG-21和NG-22)單菌落轉(zhuǎn)接于50mLYPD液體培養(yǎng)基，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h后，以1∶50的比例轉(zhuǎn)接于50mLYPD培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h后，離心收集菌體，超純水洗2次，緩沖液(100mM的磷酸鉀溶液，pH值為7.4)洗滌1次，將其重懸于10mL上述緩沖液中至菌體冷卻;將Mini型低溫高壓破碎儀(廣州聚能納米生物科技股份有限公司)的壓力調(diào)至180MPa，然后將重懸菌體破碎3次，再于4℃，14000r/min離心30min，取2mL上清液測(cè)總蛋白濃度。由于透明顫菌血紅蛋白能夠與CO結(jié)合成絡(luò)合物，在419nm處有特異的吸收峰，因此，使用低溫高壓破碎儀破碎細(xì)胞，再低溫離心細(xì)胞破碎液并取上清液，進(jìn)行CO差異光譜分析[13]。向待測(cè)蛋白樣品中連續(xù)通2min的CO，再利用Evolution220型可見(jiàn)分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]進(jìn)行全波長(zhǎng)(400～500nm)掃描。

　　1.7搖瓶發(fā)酵

　　將出發(fā)菌株NP11和重組菌株NG-20,NG-21和NG-22，分別劃線于YPD平板，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。分別挑單克隆接種于50mLYPD培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h;再將種子液分別轉(zhuǎn)接至裝有50,100mLNL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，初始OD控制為0.1，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下發(fā)酵至發(fā)酵液殘?zhí)菨舛刃∮?0g/L，收集細(xì)胞稱取細(xì)胞干重，再利用酸熱法提取油脂進(jìn)行后續(xù)分析。

　　1.8Westernblot分析

　　取2mL在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的NP11和3種工程菌株，于8000r/min離心5min，棄上清，再用雙蒸水清洗一遍;加入200μL細(xì)胞裂解液以及適量玻璃珠，利用FastPrep○R-24細(xì)胞破碎儀[安諾論(北京)生物技術(shù)有限公司]振蕩1min(4.0M/s)，冰浴1min，重復(fù)5次;取60μL細(xì)胞破碎之后的上清液加入20μL4×loadingbuffer,98℃處理10min，取10μL處理過(guò)的樣品上樣(8%分離膠)，15mA限流的條件下進(jìn)行電泳。通過(guò)濕法轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上(100mA限流，電泳50min);然后將膜37℃封閉1h，膜清洗液清洗3次，每次5min。一抗采用抗His-Tag單克隆抗體(購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;二抗選擇山羊抗小鼠IgG抗體(購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;添加顯色液進(jìn)行顯色，使用Tanon-5200Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)分析(上海天能科技有限公司)Westernblot結(jié)果。

　　1.9細(xì)胞顯微觀察

　　分別取50mL(模擬不限氧條件)和100mL(模擬限氧條件)發(fā)酵液發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的菌液，利用EVOS顯微鏡(北京東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行鏡鑒，觀察出發(fā)菌株與工程菌株的細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)油脂積累的情況。

　　2、結(jié)果與分析

　　2.1工程菌株vgb基因型驗(yàn)證

　　通過(guò)ATMT的方法將vgb整合至圓紅冬孢酵母染色體中，使用位于啟動(dòng)子的上游引物GPD-795-F與位于終止子的下游引物Thsp-129-R進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果如圖1所示。

　　圖1基因型鑒定

　　從圖1可以看出，出發(fā)菌株NP11無(wú)條帶，而3種重組菌株NG-20,NG-21和NG-22均具有預(yù)期大小的目的條帶，這表明透明顫菌血紅蛋白基因vgb已成功整合到圓紅冬孢酵母染色體上。

　　2.2透明顫菌血紅蛋白的表達(dá)及活性功能的檢測(cè)

　　Westernblot和CO差異光譜分析的結(jié)果如圖2所示。本文使用Westernblot分析VHb蛋白在重組菌株中的表達(dá)。從圖2(a)中可以看出，在工程菌株泳道中有一條清晰的VHb蛋白(VHb蛋白單體的理論大小為15.7kDa)的免疫雜交條帶，說(shuō)明重組菌株可以正常合成VHb蛋白。VHb在不同的環(huán)境條件下可呈現(xiàn)3種不同的狀態(tài)，若向含酶溶液中鼓入CO氣體，則可形成VHb-CO復(fù)合物，在419nm處呈現(xiàn)特征吸收峰。為了檢測(cè)VHb在圓紅冬孢酵母中是否具有生物活性，利用CO差異光分析方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2(b)所示[14]。從圖2(b)中可以看出，3個(gè)重組菌株NG-20,NG-21和NG-22在419nm處均具有吸收峰，而出發(fā)菌株NP11沒(méi)有吸收峰，3個(gè)重組菌株間的吸光度有所差別，這可能與VHb蛋白的表達(dá)量不同有關(guān)。綜上可知，透明顫菌血紅蛋白在圓紅冬孢酵母胞內(nèi)成功表達(dá)并且具有一定的生物活性。

　　圖2Westernblot和CO差異光譜分析

　　2.3VHb對(duì)油脂積累的影響

　　在本研究中，為了充分驗(yàn)證透明顫菌血紅蛋白對(duì)圓紅冬孢酵母油脂積累的影響，將發(fā)酵液的體積分別控制在50mL(模擬不限氧條件)和100mL(模擬限氧條件)，在容量為250mL的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果分別如圖3,4所示。

　　圖3發(fā)酵液的體積為50mL時(shí)，VHb對(duì)油脂積累的影響

　　圖4發(fā)酵液體積為100mL時(shí)，VHb對(duì)油脂積累的影響

　　從圖3中可以看出：在不限氧條件下，NG-20的葡萄糖消耗最少，其他重組菌株的葡萄糖消耗無(wú)明顯差異;出發(fā)菌株NP11的油脂產(chǎn)量為8.04g/L，油脂產(chǎn)率為57%,3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂產(chǎn)量分別為8.31,9.47,8.25g/L，油脂產(chǎn)率分別為59%,61%,58%;與出發(fā)菌株相比，NG-21的油脂產(chǎn)量提高了18%。

　　從圖4中可以看出：在限氧條件下，發(fā)酵至120h之后，3種工程菌株的葡萄糖消耗速率開(kāi)始快于出發(fā)菌株的消耗速率;在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，出發(fā)菌株的生物量為11.59g/L，而3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的生物量分別為12.69,11.29,13.38g/L，與出發(fā)菌株相比，NG-22的生物量增加了15.40%，這表明透明顫菌血紅蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng);出發(fā)菌株的油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為5.78g/L和50%，而3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂產(chǎn)量分別為7.17,5.77,7.39g/L，油脂產(chǎn)率分別為57%,51%,55%，與出發(fā)菌株相比，NG-22的油脂產(chǎn)量提高了28%。

　　2.4VHb對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

　　在限氧和不限氧條件下，出發(fā)菌株和3種工程菌株在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的細(xì)胞形態(tài)如圖5所示。

　　圖5發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的細(xì)胞形態(tài)圖

　　從圖5(a)可以看出，出發(fā)菌株和3種工程菌株的細(xì)胞相差不大，但是3種工程菌株的胞內(nèi)脂滴明顯大于出發(fā)菌株。從圖5(b)可以看出，3種工程菌株的細(xì)胞均大于出發(fā)菌株的細(xì)胞，并且胞內(nèi)脂滴也明顯大于出發(fā)菌株。這進(jìn)一步證明了vgb基因能夠提高胞內(nèi)氧氣的利用率并且促進(jìn)了胞內(nèi)油脂的積累及細(xì)胞生長(zhǎng)。

　　3、討論和結(jié)論

　　在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，細(xì)胞密度的增加須消耗更多的氧氣，將導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧量不足。透明顫菌血紅蛋白具有運(yùn)輸氧氣的功能，本研究在圓紅冬孢酵母中表達(dá)密碼子優(yōu)化后的vgb基因，發(fā)現(xiàn)在限氧和不限氧的發(fā)酵水平下，均提高了工程菌株的氧氣利用率及耐受貧氧的能力。本文的研究結(jié)果表明：在50mL的搖瓶發(fā)酵水平(不限氧條件)下，工程菌株NG-21的油脂產(chǎn)量提高了18%;在100mL的搖瓶發(fā)酵水平(限氧條件)下，工程菌株NG-22的油脂產(chǎn)量提高了28%。值得注意的是，在氧氣不足的情況下，工程菌株油脂產(chǎn)量的提高更為明顯，由此說(shuō)明，透明顫菌血紅蛋白可以提高胞內(nèi)氧氣的利用率、緩解貧氧環(huán)境下的壓力。

　　在限制氧氣和不限制氧氣條件下，VHb均能夠提高圓紅冬孢酵母細(xì)胞的氧氣利用率從而促進(jìn)油脂的積累，能夠緩解因高密度發(fā)酵導(dǎo)致氧氣不足而造成的細(xì)胞死亡及產(chǎn)量下降等問(wèn)題;同時(shí)，降低了機(jī)械力對(duì)細(xì)胞的損害，延長(zhǎng)了設(shè)備的使用壽命，縮短了發(fā)酵時(shí)間，在大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中，具有一定的應(yīng)用前景。

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