姜黃素調(diào)節(jié)SREBP和FAS改善非酒精性脂肪性肝病的研究

　　摘要：目的：探究姜黃素對(duì)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的作用和可能機(jī)制。方法：18只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和姜黃素組，每組各6只。模型組和姜黃素組予以高脂高膽固醇食物10ml/kg灌胃，對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。建模成功后，姜黃素組每日給予姜黃素100mg/kg灌胃，對(duì)照組和模型組給予等量的羧甲基纖維素鈉。治療4周后，檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)水平，HE染色觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠肝組織固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表達(dá)情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)沉默調(diào)節(jié)蛋白6(Sirt6)和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：模型組ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(P均<0.05);姜黃素組ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表達(dá)均低于模型組(P均<0.05)。模型組Sirt6、p-AMPK蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.05);姜黃素組Sirt6、p-AMPK蛋白表達(dá)均高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論：姜黃素可以減輕大鼠NALFD的脂肪沉積和肝損傷，可能與Sirt6、p-AMPK的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

　　本文源自新醫(yī)學(xué),2020,51(11):871-876.《新醫(yī)學(xué)》雜志創(chuàng)刊于1969年，是中華人民共和國(guó)教育部主管，中山大學(xué)主辦，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院承辦的綜合性醫(yī)藥衛(wèi)生類月刊。2010年獲“廣東省第四屆期刊提名獎(jiǎng)”，2012年繼續(xù)入選為中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊(中國(guó)科技核心期刊)。

　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除長(zhǎng)期大量飲酒和其他明確的肝臟損傷因素所引起的脂質(zhì)在肝細(xì)胞中儲(chǔ)積為病理改變的肝臟代謝性疾病。近年來(lái)，NAFLD逐漸成為全球最常見(jiàn)的慢性肝病[1]。目前關(guān)于NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，現(xiàn)被公認(rèn)的是“二次打擊學(xué)說(shuō)”。其可能的機(jī)制有氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)以及自噬與DNA損傷等[2,3,4]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)和碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)合成的關(guān)鍵性基因，進(jìn)而參與調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝過(guò)程[5,6]。因此，通過(guò)尋找有效藥物抑制SREBP表達(dá)，對(duì)于改善NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂至關(guān)重要。

　　姜黃素是一種多酚類物質(zhì)，從植物姜黃中提取。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具備抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗自噬、抗胰島素抵抗等作用，且對(duì)于糖尿病、COPD、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病的治療都有確切的效果。既往研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP，進(jìn)而參與肝臟脂質(zhì)代謝[7]。在NAFLD大鼠中，降脂顆粒可以通過(guò)下調(diào)肝X受體α和SREBP-1c的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪酸代謝[8]。但是有關(guān)姜黃素對(duì)SREBP調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)構(gòu)建NAFLD型大鼠模型，探究姜黃素對(duì)SREBP的分子調(diào)控機(jī)制。

　　材料與方法

　　一、材料

　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　實(shí)驗(yàn)選取雄性SPF級(jí)別，體質(zhì)量為180～200g的SD大鼠共18只(購(gòu)于錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)并通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20190816)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于濕度在30%～70%、溫度維持在25℃的動(dòng)物房?jī)?nèi)并采取晝夜交替光照處理。

　　2.主要實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

　　膽固醇(萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：2017031625)，姜黃素(上海瑞永生物科技有限公司)，SREBP一抗和脂肪酸合成酶(FAS)一抗抗體(武漢Proteintech)，沉默調(diào)節(jié)蛋白6(Sirt6)一抗(武漢博士德公司)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)一抗(美國(guó)CellSignalingTechnology)，β-actin一抗(江蘇碧云天公司)PVDF膜(Millipore公司)，SDS-PAGE凝膠(武漢博士德公司)，一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天公司)。

　　3.主要實(shí)驗(yàn)儀器

　　純水儀器(湖南湘儀公司)，酶標(biāo)儀(江蘇碧云天公司)，組織切片機(jī)(武漢賽默飛公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olmpus公司)，凝膠電泳裝置(北京六一生物科技有限公司)，顯影儀(上海西唐生物科技有限公司)，脫色搖床(上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司)，高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

　　二、方法

　　1.造模及分組

　　將18只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，每組各6只，即為對(duì)照組、模型組、姜黃素組。模型組和姜黃素組予以高脂高膽固醇食物10ml/kg灌胃，對(duì)照組給予生理鹽水10ml/kg灌胃。其中高脂高膽固醇食物的配制為60%豬油、10%膽固醇及30%玉米面加200ml食用水，熬制成糊狀，放入37℃恒溫箱內(nèi)，對(duì)照組給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)。3個(gè)月后隨機(jī)處死模型組和姜黃素組各1只大鼠，肝臟病理見(jiàn)肝脂肪細(xì)胞變性表明建模成功。姜黃素組給予姜黃素100mg/kg按每日1次給藥;對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃;持續(xù)給藥4周。隔夜禁食水，次日清晨予大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，稱重、解剖并左心室采血，取部分肝臟組織浸泡于4%的多聚甲醛，經(jīng)脫水、石蠟包埋后行HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

　　2.相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

　　按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行大鼠血清中ALT、AST、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量測(cè)定。HE染色：4%的多聚甲醛固定大鼠肝臟組織，石蠟包埋后切片，之后行HE染色操作。免疫組織化學(xué)染色：(1)石蠟切片60℃下烘烤1h;(2)脫蠟至水，二甲苯處理3次，每次5min，無(wú)水乙醇處理3次，每次10min,95%乙醇處理2次，每次10min,ddH2O洗2次，每次5min,0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次10min;(3)消除過(guò)氧化物酶體，3%H2O2溶液孵育10min,0.01mmol/LPBS洗3次，每次5min;(4)微波抗原修復(fù)，枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)250ml置于微波爐中450W預(yù)熱5min，將組織放入緩沖液中，微波250W加熱10min，冷卻至室溫，約耗時(shí)40min，雙蒸水洗3次，每次5min,PBS洗3次，每次5min;(5)封閉，利用5%的BSA封閉1h;(6)打孔透膜，利用0.3%的TritonX-100孵育10min;(7)一抗孵育，4℃濕盒孵育SREBP和FAS抗體過(guò)夜;(8)二抗孵育;(9)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明;(10)中性樹(shù)膠封片和顯微鏡下觀察結(jié)果。

　　蛋白免疫印跡法：(1)組織碾磨，將處理完成的各組大鼠肝臟組織取出，采用PBS清洗后并用手術(shù)剪刀剪取少許肝臟組織放置于組織碾磨管內(nèi)，按照1∶5的比例加入組織裂解液后放置于組織碾磨儀中充分碾磨3～5min;(2)離心，4℃以12000rpm離心15min，取組織上清液;(3)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，利用二辛可寧酸(BCA)法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量測(cè)定;(4)凝膠電泳，按照上樣量為40μg進(jìn)行蛋白凝膠電泳120min;(5)轉(zhuǎn)膜，依據(jù)蛋白質(zhì)marker指示進(jìn)行切膠，并放置聚偏二氟乙烯(PVDF)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜約90min;(6)封閉，5%的脫脂牛奶封閉1～2h;(7)孵育一抗，洗脫完成，孵育對(duì)應(yīng)的一抗過(guò)夜;(8)孵育二抗，室溫條件下，二抗孵育約2h;(9)顯影，將孵育完成的PVDF膜使用吐溫-20的PBS洗滌2～3次，每次5min，滴加顯影液顯影并拍照。

　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　結(jié)果

　　一、姜黃素對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

　　與對(duì)照組相比，模型組ALT、AST、TG和TC增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);與模型組相比，姜黃素組ALT、AST、TG和TC均降低(P均<0.05)。

　　二、HE染色觀察大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

　　與對(duì)照組相比，模型組肝小葉內(nèi)彌漫性分布著空泡細(xì)胞，空泡大小不一，肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，邊界模糊，有淋巴細(xì)胞分布于肝臟。相比于模型組，姜黃素組的肝小葉內(nèi)空泡細(xì)胞明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝臟內(nèi)的空泡細(xì)胞數(shù)量最少，見(jiàn)圖1。

　　表1各組血清生化比較

　　圖13組肝臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)

　　三、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠肝臟組織中的SREBP和FAS表達(dá)

　　SREBP和FAS的定位都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)：與對(duì)照組相比，模型組SREBP和FAS的表達(dá)增加;與模型組相比，姜黃素組SREBP和FAS的表達(dá)減少，見(jiàn)圖2。

　　四、姜黃素對(duì)大鼠肝臟Sirt6和p-AMPK表達(dá)的影響

　　3組肝臟組織Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FSirt6=12.83,PSirt6=0.001;Fp-AMPK=16.67,Pp-AMPK<0.001)，相比于對(duì)照組，模型組Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)降低(P均<0.05);與模型組相比，姜黃素組Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)，見(jiàn)圖3。

　　討論

　　NAFLD是以彌漫性肝細(xì)胞脂肪病變而導(dǎo)致的一種病理性臨床病理綜合征。NAFLD是一種進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常、炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激所致肝細(xì)胞凋亡等因素是NAFLD發(fā)生和發(fā)展的主要原因[9]。現(xiàn)有研究者提出在NAFLD的“二次打擊學(xué)說(shuō)”中，初次主要是胰島素抵抗所致，胰島素抵抗主要通過(guò)促使外周脂解增加和高胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪蓄積，并增加了對(duì)內(nèi)、外源性損害因子敏感性。二次打擊主要為反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物、脂肪細(xì)胞因子、腸應(yīng)激和腸道菌群內(nèi)毒素等各種損害因子誘導(dǎo)活動(dòng)UCP-2、FAS配體等，進(jìn)而使得脂肪變性的肝細(xì)胞出現(xiàn)炎癥、壞死等一系列病理生理學(xué)改變[10,11,12]。

　　圖肝臟和-蛋白表達(dá)

　　圖肝臟和的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

　　NAFLD是指中性脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)以脂滴或者脂質(zhì)囊泡的形式在胞質(zhì)中過(guò)度積累。在諸多研究中發(fā)現(xiàn)總膽固醇在NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎形成和發(fā)展中所起的脂毒性作用尚不完全清楚。因此，通過(guò)研究NAFLD中膽固醇合成和代謝的相關(guān)基因顯得尤為重要。SREBP屬于螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(bHLH-ZIP)結(jié)構(gòu)家族，是一種節(jié)脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄因子家族，是由SREBP1a、SREBP1c、SREBP2三種亞型構(gòu)成[13,14]。多項(xiàng)研究均指出SREBPS在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來(lái)諸多研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)降低TG、TC改善NAFLD。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)下調(diào)節(jié)SREBP和FAS表達(dá)，減少脂質(zhì)在肝臟內(nèi)沉積，降低脂毒性對(duì)肝臟損害，進(jìn)而保護(hù)肝臟細(xì)胞，使得病情得以逆轉(zhuǎn)，從而治療NAFLD[15]。對(duì)此本研究初步研究發(fā)現(xiàn)，相比于模型組，通過(guò)姜黃素大鼠灌胃處理的NAFLD組SREBP和FAS的表達(dá)明顯下降，AST、ALT、TG和TC水平均明顯降低。上述結(jié)果表明，姜黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP和FAS，從而降低TG、TC等合成，改善NAFLD。那么姜黃素是通過(guò)何種分子機(jī)制調(diào)控SREBP表達(dá)?

　　Sirt6是Sirtuins家族成員之一，具有高度保守的NAD+依賴性的去乙酰化酶，可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合酶而發(fā)揮抗心肌肥大的作用[16]。以往研究發(fā)現(xiàn)，Sirt6基因缺失是導(dǎo)致TG累積的主要因素，與脂肪性肝臟疾病密切相關(guān)[17]。在高脂喂養(yǎng)的小鼠中Sirt6的表達(dá)顯著降低，通過(guò)過(guò)表達(dá)Sirt6可以降低小鼠血液脂質(zhì)含量，減少肝臟內(nèi)脂肪的積累[18]。亦有研究證實(shí)，Sirt6可以通過(guò)增加AMP/ATP比例，活化AMPK信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控SREBP蛋白表達(dá)[19]。因此，在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠肝臟組織中Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，模型組Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)均明顯降低，給予姜黃素處理可以促進(jìn)Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)，進(jìn)而改善NAFLD。綜上所述，姜黃素可以減輕大鼠NALFD的脂肪沉積和肝損傷，可能與Sirt6、p-AMPK的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。以上研究結(jié)果為姜黃素治療NAFLD提供了新的理論依據(jù)。

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