作者：葉文 楊柳青 張如勝 歐新華 宋克云 單位：長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科

沙門(mén)菌屬是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原體之一,目前全世界已分離出2523個(gè)血清型,我國(guó)已發(fā)現(xiàn)216個(gè)[1]。快速敏感的檢測(cè)方法對(duì)沙門(mén)菌食品衛(wèi)生檢測(cè)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)方法煩瑣費(fèi)時(shí);免疫學(xué)方法敏感度有待提高;各種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法具有敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)[2-5],但由于需要特殊的儀器設(shè)備而限制了其在基層單位的應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalam-plification,LAMP)技術(shù)[6,7]是一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法,針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)4~6條引物,利用一種具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,在恒溫條件(60~65℃)保溫約60min,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng),產(chǎn)物為針對(duì)靶基因擴(kuò)增產(chǎn)生的各種大小的莖環(huán)狀DNA混合物,副產(chǎn)物為肉眼可見(jiàn)的白色焦磷酸鎂沉淀。目前已有多篇針對(duì)沙門(mén)菌的LAMP檢測(cè)研究報(bào)道[8,9],這些研究多側(cè)重于檢測(cè)方法的建立,大多和核酸檢測(cè)方法,如PCR方法進(jìn)行對(duì)照研究,而且用于實(shí)際樣品檢測(cè)研究也較少。為此,本文利用文獻(xiàn)報(bào)道的沙門(mén)菌屬LAMP檢測(cè)方法[8]對(duì)135份食品標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測(cè),同時(shí)和分離培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)沙門(mén)菌屬LAMP檢測(cè)方法在食品衛(wèi)生檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司);DK-8D電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(美國(guó)BD公司);BstDNA聚合酶(北京紐英倫生物技術(shù)有限公司);Betaine、Mg-SO4(美國(guó)Sigma-Aldrich公司);SYBRGreenInu-cleicacidgelstain、SYBRSafeDNAGelStain(美國(guó)invitrogen);dNTP(北京天根公司);通用型核酸提取試劑盒(廣州華瑞安生物);緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、三糖鐵瓊脂(TSI)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.2標(biāo)本來(lái)源2010年7月~10月收集的食品標(biāo)本135份(冷凍生肉:16份;生鮮肉:20份;熟肉制品:21份;即食非發(fā)酵豆制品:17份;速凍米面制品:16份;冰激凌:10份;生水產(chǎn)品:18份;沙拉:6份;鮮榨果汁:7份;生食類蔬菜:4份),見(jiàn)表1。陽(yáng)性控制菌株為腸炎沙門(mén)菌。

1.2方法

1.2.1食品樣品的前增菌參照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[10]標(biāo)準(zhǔn)將收集的食品標(biāo)本分別取25g,加入到225mlBPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min后37℃培養(yǎng)8~18h,如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min解凍。

1.2.2LAMP檢測(cè)食品中的沙門(mén)菌分別取1ml食品標(biāo)本前增菌液10000r/min離心2min,棄其上清液后,利用核酸通用提取試劑盒進(jìn)行核酸提取,再取1μl上清液做待檢模板DNA。利用文獻(xiàn)[2,10]報(bào)道的LAMP檢測(cè)方法及引物對(duì)135份食品標(biāo)本增菌液DNA進(jìn)行檢測(cè),反應(yīng)體系(25μl):FIP、BIP(40μM)各1.0μl,F3、B3(10μM)各0.5μl,10×BstDNA聚合酶Buffer2.5μl,dNTPMixture(10mM)3.5μl,Betaine(5M)5.0μl,Mg-SO4(250mM)0.6μl,BstDNA聚合酶(8U/μl)1.0μl,DNA模板2μl,加ddH2O至25μl。輕彈混勻后于水箱內(nèi)65℃孵育60min,80℃2min滅活酶結(jié)束LAMP反應(yīng)。LAMP反應(yīng)結(jié)束后可直接進(jìn)行肉眼檢測(cè):檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性,未見(jiàn)渾濁為陰性;也可將LAMP產(chǎn)物加熒光染料(1000×SYBRGreenI)2μl,1~5min觀察結(jié)果,反應(yīng)液變綠為陽(yáng)性,保持無(wú)色或棕色為陰性。電泳鑒定:1μl擴(kuò)增產(chǎn)物與0.2μl上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣于含適量SYBRSafeDNAGelStain的2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳約60~100min,電泳圖片顯示為最小片段>100bp的LAMP特征性梯狀條帶,結(jié)果為陽(yáng)性;如無(wú)任何條帶則結(jié)果為陰性;如見(jiàn)最小片段<100bp的梯狀條帶,則判斷為非特異性擴(kuò)增,需要重新檢測(cè)。

1.2.3食品中沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)鑒定參照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[10]標(biāo)準(zhǔn)分別將135份培養(yǎng)過(guò)的食品標(biāo)本前增菌液輕輕搖動(dòng)后取1ml,轉(zhuǎn)種于10mlTTB增菌液內(nèi),于42℃培養(yǎng)18~24h。另取1ml,轉(zhuǎn)種于10mlSC增菌液內(nèi),于37℃培養(yǎng)18~24h;分別取食品標(biāo)本的增菌液1環(huán),劃線接種于一個(gè)BS平板和一個(gè)XLD平板,于37℃培養(yǎng)18~24h;挑取3個(gè)可疑菌落,接種TSI、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,于37℃培養(yǎng)18~24h。如果生化反應(yīng)初步符合沙門(mén)菌特征,從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)菌懸液,使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行分析,必要時(shí)做血清學(xué)分型。若BS平板和XLD平板上都無(wú)可疑菌落,將BS平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)18~24h,仍無(wú)可疑菌落可確定為沙門(mén)菌陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析方法為配對(duì)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1沙門(mén)菌LAMP檢測(cè)和分離培養(yǎng)結(jié)果135份食品標(biāo)本增菌液經(jīng)LAMP檢測(cè)出沙門(mén)菌屬陽(yáng)性標(biāo)本14份,陽(yáng)性率為10.4%;經(jīng)分離培養(yǎng)法分離出沙門(mén)菌陽(yáng)性菌株6份,陽(yáng)性率為4.4%,見(jiàn)表1。電泳檢測(cè)結(jié)果,凝膠瓊脂糖電泳出現(xiàn)最小片段>100bp的LAMP特征性梯狀條帶為陽(yáng)性,見(jiàn)圖1。

2.2兩種方法檢測(cè)結(jié)果LAMP法和分離培養(yǎng)法兩種檢測(cè)方法皆為陽(yáng)性有5份;兩種檢測(cè)方法皆為陰性有120份;LAMP法陽(yáng)性而分離培養(yǎng)法為陰性有9份;分離培養(yǎng)法陽(yáng)性而LAMP法為陰性有1份。LAMP法檢測(cè)陽(yáng)性率高于分離培養(yǎng)法(P=0.021),見(jiàn)表2。

3討論

本研究中利用LAMP方法對(duì)實(shí)際食品標(biāo)本的前增菌液進(jìn)行核酸檢測(cè),并和平行檢測(cè)的分離培養(yǎng)法進(jìn)行了檢出率的比較。結(jié)果顯示,LAMP法檢出率更高,達(dá)10.4%,而分離培養(yǎng)法只有4.4%,LAMP法檢測(cè)陽(yáng)性率更高。研究中參照的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[10]需要經(jīng)過(guò)前增菌、增菌、分離、篩選可疑菌落、生化和血清學(xué)鑒定這幾個(gè)步驟,得到陰性結(jié)果往往需要4d左右,檢出沙門(mén)菌至少需要7d。

另外,分離培養(yǎng)法的生化鑒定存在繁瑣或需要昂貴的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的不足之處血清學(xué)分型也存在效價(jià)低、試劑昂貴和易失效等缺點(diǎn)不利于基層特別是區(qū)縣疾病預(yù)防控制中心的使用。分離培養(yǎng)法需要經(jīng)過(guò)兩次增菌后再進(jìn)行分離培養(yǎng),而LAMP法檢測(cè)只需要采用前增菌液進(jìn)行核酸提取后即可開(kāi)始LAMP擴(kuò)增試驗(yàn),在60min即可以完成LAMP擴(kuò)增過(guò)程,本研究利用LAMP方法可以在24h(包括食品標(biāo)本的前增菌過(guò)程)內(nèi)檢出食品標(biāo)本中的沙門(mén)菌屬,相比分離培養(yǎng)法更快速。另外,LAMP法還可以利用肉眼判斷結(jié)果,比較直觀方便,這對(duì)生鮮食品的快速檢測(cè)具有重要意義。