作者：杜林 李蓮 單位：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院 中山大學(xué)生命科學(xué)院

我們的初步研究表明，線粒體產(chǎn)生的活性氧和甲酸誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡關(guān)系密切［9］。因此，我們推測，降低酵母菌線粒體活性，抑制活性氧的產(chǎn)生，可以增強(qiáng)釀酒酵母對甲酸的抗性。儀器與設(shè)備恒溫?fù)u床(哈爾濱東明儀器HZQ－C);培養(yǎng)箱(Thermo);流式細(xì)胞儀(VantageSE，BDBiosci-ences)。酵母菌菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基釀酒酵母BY4741由美國Rochester大學(xué)的Da-vidGoldfarb教授惠贈。釀酒酵母W303－1a野生型菌株由中山大學(xué)微生物遺傳實(shí)驗室提供，W303－1a背景ATP酶4亞基基因缺失株由中山大學(xué)微生物遺傳實(shí)驗室構(gòu)建。YPD液體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%D－(+)－葡萄糖，分裝后121℃高壓滅菌20min。

酵母細(xì)胞的培養(yǎng)及甲酸處理后的酵母細(xì)胞存活率測定取對數(shù)期釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液0.5mL，接種至裝于250mL三角瓶中的50mLYPD液體培養(yǎng)基中，置于30℃，200r/min往復(fù)式振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)期或穩(wěn)定期，分別取1mL菌液于1mL離心管中，立即加入相應(yīng)摩爾濃度的甲酸，30℃處理40min后，在YPD培養(yǎng)基上以標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法計數(shù)，每一稀釋度涂3個平板，以3次獨(dú)立的實(shí)驗結(jié)果計算存活率。

細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)的流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞質(zhì)中活性氧檢測:取5mLYPD加入試管中，接入50μL過夜培養(yǎng)的酵母菌液，搖床培養(yǎng)6h(30℃，200r/min)。吸取以DMSO為溶劑的10mmol/L雙乙酸二氯熒光黃(dichlorofluoresceindiace-tate，DCFH-DA)溶液2μmol/L，使染色時DCFH-DA的工作濃度為20μmol/L，避光孵育15min，使DCFH-DA充分進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)需要，迅速加入一定量的1mol/L甲酸，室溫或培養(yǎng)箱恒溫避光處理，根據(jù)實(shí)驗要求，分別吸取100μL處理中的各樣品菌液加入FACS管中，加入900μL冷藏的PBS，立即以流式細(xì)胞儀上樣分析。所用氬離子激光器激光波長為488nm，在530nm檢測激發(fā)出的熒光，以流式細(xì)胞儀FL－1通道進(jìn)行檢測。或加入PI后以FL－1和FL－2通道檢測。超氧陰離子的檢測:先以無菌DMSO配置10mmol/L的超氧化物陰離子熒光探針二氫溴化乙錠(Dihydroethidium，DHE)溶液，取0.5μL加于1mL菌液，使DHE的終濃度為5μmmol/L，30℃避光孵育15min，加入相應(yīng)濃度甲酸避光處理，以流式細(xì)胞儀FL-2通道進(jìn)行分析。激發(fā)光波長為535nm，發(fā)射光波長為610nm。

甲酸處理導(dǎo)致線粒體超氧陰離子的產(chǎn)生與自由基的擴(kuò)散為了了解活性氧爆發(fā)時細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過氧化氫等活性氧的水平，故使用活性氧熒光探針DCFH-DA和DHE同

時對甲酸處理時細(xì)胞中的活性氧進(jìn)行檢測。由圖1可見，在用甲酸處理10min時，以熒光探針DCFH-DA和DHE依次檢測到活性氧的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)DHE陽性率超過DCFH-DA的陽性率，顯示DHE氧化后的熒光先產(chǎn)生。這和兩種熒光染料的特性有關(guān)，DHE可檢測線粒體產(chǎn)生的超氧陰離子，DCFH-DA可反映細(xì)胞質(zhì)中的活性氧水平。線粒體電子傳遞鏈障礙導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生時，超氧陰離子首先產(chǎn)生。所以實(shí)驗中首先檢測到較多的細(xì)胞產(chǎn)生了超氧陰離子，而此時以DCFH-DA檢測到的細(xì)胞質(zhì)活性氧陽性的細(xì)胞卻比超氧陰離子陽性的細(xì)胞少，說明細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的活性氧是由線粒體內(nèi)超氧陰離子擴(kuò)散形成。

還原劑預(yù)處理對活性氧爆發(fā)及存活率的影響N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，是細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體，因為能夠快速穿過細(xì)胞膜，因此是一種細(xì)胞生物學(xué)研究中廣泛使用的還原劑。NAC可在細(xì)胞內(nèi)形成含巰基的代謝產(chǎn)物，促進(jìn)GSH的合成，消除自由基。在用甲酸處理酵母細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)前我們先用NAC預(yù)處理細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)NAC達(dá)到較高濃度以抑制活性氧的水平，檢測抑制活性氧對細(xì)胞存活率的影響。由圖2可見，和對照相比，2mmol/L的NAC預(yù)處理明顯降低了死亡率，說明細(xì)胞內(nèi)還原劑的增加，活性氧的抑制可降低甲酸處理后細(xì)胞的死亡率。有可能是由于NAC減少了活性氧，從而抑制了活性氧對酵母細(xì)胞的損傷。另外，使用PI染色后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜完整性的方法也證明NAC預(yù)處理可以降低甲酸處理后的酵母細(xì)胞死亡率。

釀酒酵母線粒體活性對甲酸處理下細(xì)胞存活率的影響在病理和生理條件下，通常線粒體都是活性氧的主要來源。線粒體電子傳遞鏈的障礙，往往導(dǎo)致活性氧的大量形成。而在不同遺傳性狀的釀酒酵母細(xì)胞中，或同一種細(xì)胞處在不同的生長條件下，其線粒體活性往往有很大差異［10］。因此我們對不同類型釀酒酵母細(xì)胞中活性氧的爆發(fā)及細(xì)胞死亡情況進(jìn)行了研究。

酵母細(xì)胞菌齡對甲酸處理時細(xì)胞死亡率的影響和穩(wěn)定期細(xì)胞相比，對數(shù)期的酵母細(xì)胞代謝更為旺盛，其線粒體活性更高，因此我們推測同濃度甲酸在對數(shù)期酵母細(xì)胞中能導(dǎo)致更猛烈的活性氧爆發(fā)，從而對細(xì)胞造成更大的破壞，因此用甲酸處理培養(yǎng)24h的穩(wěn)定期細(xì)胞時活性氧產(chǎn)生情況，并比較培養(yǎng)6h的對數(shù)期細(xì)胞和培養(yǎng)24h的穩(wěn)定期細(xì)胞在同濃度甲酸處理時的存活率。由圖3可見，對數(shù)期細(xì)胞對甲酸的敏感程度比穩(wěn)定期細(xì)胞高得多，這在甲酸濃度較高時更為明顯。故甲酸的毒性和酵母細(xì)胞的代謝狀態(tài)密切相關(guān)。因此可以認(rèn)為，對數(shù)期細(xì)胞由于處于代謝旺盛的特點(diǎn)，其細(xì)胞內(nèi)較高活性的線粒體在甲酸處理下產(chǎn)生更多的活性氧，從而導(dǎo)致更多的對數(shù)期細(xì)胞死亡。

低溫預(yù)處理對甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率的影響由于線粒體的產(chǎn)能速度和微生物細(xì)胞外環(huán)境密切相關(guān)，即細(xì)胞外因素會影響線粒體活性，因此我們推測低溫預(yù)處理降低線粒體活性后，再以甲酸處理細(xì)胞，這時線粒體活性氧爆發(fā)應(yīng)該減弱，細(xì)胞的死亡率應(yīng)該下降。故在加入甲酸之前，先將細(xì)胞置于4℃10min，再將其和正常培養(yǎng)的對照樣品同時加入甲酸處理40min，然后以標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法比較二者的存活率。在本實(shí)驗中，我們還對另一實(shí)驗室研究常用的釀酒酵母BY4741進(jìn)行了測定。由圖4可見，短時間的低溫預(yù)處理，即可明顯提高甲酸處理后的細(xì)胞存活率。該結(jié)果也表明，甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和細(xì)胞的代謝狀態(tài)有關(guān)。

線粒體呼吸缺陷對甲酸處理細(xì)胞存活率的影響ATP酶結(jié)構(gòu)上的缺陷會影響其合成ATP的能力及線粒體的整體活性。所以我們通過敲除ATP酶亞基基因的方法，降低線粒體的活性，以期減弱甲酸誘導(dǎo)的活性氧的爆發(fā)并提高細(xì)胞存活率，并采用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法對同濃度甲酸處理后野生型和ATP酶4亞基缺失株的存活率進(jìn)行了比較。由圖5可見，線粒體缺陷會大大提高細(xì)胞的存活率，分析其原因，推測是在線粒體活性較低的情況下，甲酸誘導(dǎo)其產(chǎn)生的活性氧較少，故活性氧對細(xì)胞的破壞較小，所以細(xì)胞的存活率明顯上升。此外，我們還發(fā)現(xiàn)位于線粒體外膜的AIF基因缺失后，其線粒體膜電位會下降，同時細(xì)胞對甲酸的抗性也會增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未列出)。