作者：唐迪 趙婷 仰榴青 單位：江蘇農林職業技術學院 江蘇大學食品與生物工程學院 江蘇大學化學化工學院

釀酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜蘆醇標準品(中國藥品生物制品檢定所生產);甲醇為上海化學試劑有限公司生產，色譜純;其他試劑均為市售分析純。料處理釀酒葡萄渣在60℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中烘24h，粉碎后過40目篩，置干燥器中備用。白藜蘆醇的提取［13－15］精密稱取30g釀酒葡萄渣原料，以80%乙醇作為提取溶劑，液料比為10mL∶1g，提取溫度為60℃，共提取3次，每次提取時間為2h，第2、3次提取前各超聲10min，合并3次所得濾液，在40℃條件下用旋轉蒸發儀濃縮至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得釀酒葡萄渣提取樣品。

樣品預凈化處理(1)白藜蘆醇的定性鑒定。白藜蘆醇在365nm處顯藍紫色熒光。用薄層層析法檢測，展開劑為三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)時，根據標準品Rf值=0．638定性鑒定白藜蘆醇的存在，從而能有效控制預處理過程。點樣:取活化好的硅膠GF254板，薄層板尺寸為:10cm×20cm，距薄板一端約1．5cm處，用鉛筆輕輕劃1條與底邊平行的直線，確定各樣品點樣位置。然后分別用毛細管吸取白藜蘆醇標準溶液、釀酒葡萄渣溶液進行點樣。樣點之間的距離約1cm，薄層兩邊距離約1cm。展開:將點樣好的薄層板置于展開劑中，上行展開15cm，取出，揮干溶劑。檢測:在365nm紫外燈下觀察熒光斑點。(2)樣品預凈化處理。準確吸取0．5mL提取樣品，加樣于硅膠柱上(硅膠10g，硅膠柱為10mm×250mm的玻璃柱，濕法裝柱)。用約35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)洗脫，依據上述方法跟蹤鑒定，收集白藜蘆醇組分，濃縮至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45μm濾膜過濾得樣品溶液。平行處理3個樣品，待HPLC測定。1．3．4白藜蘆醇含量測定(1)檢測波長的選擇。以甲醇作為溶劑空白，在220～400nm處對白藜蘆醇標準品溶液進行掃描，確定白藜蘆醇的最大吸收波長。(2)HPLC色譜分析條件。色譜條件:色譜柱HypersilODS(4．6mm×250mm，5μm);流動相－甲醇－水(體積比45∶55);流速0．8mL/min;柱溫35℃;檢測波長:306nm;色譜工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外標曲線的測定。準確稱取白藜蘆醇標準品，用甲醇－水(體積比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分別從中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分別定容至10mL，用0．45μm濾膜過濾，得濃度分別為1．65、3．3、4．95、6．6、8.25μg/mL的白藜蘆醇標準溶液。在上述色譜條件下進樣10μL，平行測定3次，求其峰面積的平均值，計算得外標曲線。(4)釀酒葡萄渣中白藜蘆醇含量測定。將“1．3．3”預凈化處理過的樣品進樣20μL，平行測定3次，計算白藜蘆醇的峰面積，根據外標曲線求出白藜蘆醇的含量。

檢測波長的選擇白藜蘆醇的紫外吸收光譜圖見圖1。可見最大吸收波長為306nm，與前人研究結果一致，故本研究選擇306nm為檢測波長。

外標曲線的確定白藜蘆醇標準品的HPLC圖見圖2。以對照品進樣量(μg)x對峰面積積分值y進行線性回歸，結果表明，白藜蘆醇在0．0165～0．0825μg范圍內線性關系良好，其線性方程為y=7×106x－82231(r=0．9999)。

重現性試驗按“1．3．4”(4)方法處理樣品，平行5份，測定白藜蘆醇的峰面積，其5次測定的RSD為4．8%，重現性好。

穩定性試驗按“1．3．4”(4)方法處理樣品，精密吸取同一樣品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分別進樣測定峰面積，RSD為1.2%(n=9)，可見樣品在24h內基本穩定。

加樣回收率試驗加20μg白藜蘆醇標準品于釀酒葡萄渣樣品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法處理樣品并進行HPLC測定，每個樣品平行測定3次，求平均峰面積，根據外標曲線計算加樣回收率。5次測定的白藜蘆醇的回收率為94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率為98．9%，RSD為5.04%(n=5)。

釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量測定釀酒葡萄渣預處理樣品的HPLC圖譜見圖3。經過一步硅膠柱預處理，不僅白藜蘆醇得到了富集，且白藜蘆醇峰與其他雜質峰得以完全分離，無雜質峰干擾，預處理凈化效果好。試驗測得河北釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量為6．482μg/g干葡萄渣，而新疆釀酒葡萄渣中未檢測到白藜蘆醇。

采用一步硅膠柱預處理方法可用于釀酒葡萄渣中白藜蘆醇含量的HPLC測定，線性回歸方程為y=7×106x－82231(r=0．9999)，線性范圍為0．0165～0．0825μg，精密度和重現性好，平均加樣回收率為98．9%，RSD為5．04%(n=5)。測得河北釀酒葡萄渣提取物預處理樣品中白藜蘆醇的含量為6．482μg/g，新疆釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量甚微，HPLC無法檢測。HPLC方法簡便，快速，可用于白藜蘆醇的定量分析。

由于葡萄渣中白藜蘆醇的含量少，釀酒葡萄渣提取物用硅膠柱預處理效果好，可有效去除影響色譜柱使用壽命的脂溶性雜質，也使白藜蘆醇得到了富集，能進行HPLC測定。結果表明，不同產地的釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量不同，可能與釀酒工藝及葡萄的品種有關;釀酒后的葡萄渣中白藜蘆醇的含量低于相關資料的鮮食葡萄皮中的含量，與葡萄酒中白藜蘆醇的含量較高相吻合。