蛋白質的體外消化模型

蛋白質是食品的重要成分之一，涉及到的蛋白質消化酶及消化條件有比較好的研究基礎，且相對明確，因此，針對蛋白質的體外消化模型研究的最早，相關的研究和應用報道也較多。

1.蛋白質體外消化模型建立的主要依據

消化蛋白質的酶主要是蛋白酶，食物經過口腔的咀嚼，經由咽、食管、進入胃、小腸中，在蛋白酶比較豐富的胃腸開始消化過程。體外實驗中酶的濃度、反應溫度、pH、時間及抑制劑、激活劑都是影響蛋白質消化的重要因素，且消化不同食物來源的蛋白質的酶種類不同，它們刺激腸胃產生的酶量不同、所需消化時間也不同。在模擬消化的過程中，一般模擬的部位主要是胃和小腸，在胃中水解蛋白質的胃液主要由胃蛋白酶和胃酸組成。小腸中的蛋白質消化相對復雜，由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和肽酶、羧肽酶 A、B 等組成，可將經胃消化所得的肽或蛋白質進一步水解為氨基酸和小肽。蛋白質體外消化模型一般以蛋白質的消化率為測定參數，消化率是動物從食物中所消化吸收的蛋白質占總攝入量的百分比，是評價食物營養價值的重要指標。Abdel-Aal[6]研究表明，蛋白酶的種類及酶作用順序和過程會對蛋白質的消化率產生影響。他們用三種酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶）同時消化蛋白質，對比兩種酶（胃蛋白酶和胰液素）分兩步消化蛋白質，就蛋白質的消化率而言，發現前者比后者高 39-66%。席鵬彬等[7]在研究菜粕的體外消化中也發現，如果用胰酶制劑代替胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步酶解過程中的胰蛋白酶可使菜粕干物質和粗蛋白質的消化率分別提高 5.2%和 11%。所以，復合酶體系更符合體內的消化狀況[1]。另外，攝食的蛋白量增大會引起胰液素蛋白酶的分泌增多，同樣地，淀粉和脂質的攝入量增加會分別引起唾液淀粉酶和酯酶分泌增多，即食物組成和攝入量的不同會引起相應的酶分泌增加或減少，建立體外消化模型時也需考慮這方面的因素。單酶法可用來預測單個物質的可消化性，例如，淀粉的消化主要用淀粉酶，脂質的消化主要用脂肪酶、蛋白質消化用蛋白酶[1]。單酶消化法要比運用復合酶消化更有利于消化模型的標準化，但實際上，食用物質中各種營養物質相互作用，彼此間相互影響，所以就實用性而言，復合酶體系占優勢[2]。

2.體外消化模型在食物蛋白質研究中的應用

近十年來被用于蛋白質營養代謝、生理活性、過敏原檢測等方面研究的體外消化模型中，主要以谷物類蛋白，奶制品中的蛋白質，以及水產品和一些果蔬中的蛋白質為研究對象。谷物類作為人們食物的主要來源，其蛋白質是主要研究對象，如對小麥蛋白[6]、大豆蛋白[8]、菜粕粗蛋白[9]等都有研究。在這些體外消化模型中，所采用的消化酶主要是胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰液素，牛奶作為膳食中蛋白質的主要來源之一也是蛋白質體外消化模型的主要研究對象，如對牛奶蛋白[10]、山羊奶蛋白[11]、牛乳清蛋白[12]、瑞士干酪[13]、β-乳球蛋白[14]的研究。上述體外消化模型因研究對象和目的不同，采用的消化酶組成和 pH 也不盡相同。例如在研究牛乳清蛋白時，研究者首先模擬胃部消化環境，在體外采用豬胃蛋白酶、牛科動物的凝乳蛋白酶、胃蛋白酶以及不同 pH 的小鼠胃液對牛乳清蛋白進行消化，結果表明在不同消化酶的作用下 α-乳白蛋白和牛血清白蛋白被水解了而 β-乳球蛋白在不同的消化酶和不同 pH 作用下都沒能水解，可見加熱變性的乳清蛋白包括 β-乳球蛋白都被胃蛋白酶徹底水解了。在進行體內試驗時出現了與體外試驗相同的結果，天然的 β-乳球蛋白在小鼠體內未能消化但是加熱變性的 β-乳球蛋白卻在小鼠胃內消化了，與胃部體外模擬實驗結果一致。接著，研究者在體外模型和小鼠體內分別研究蛋白質在腸中的消化，在體外用胰液素去消化天然的和變性的 β-乳球蛋白，二者都被消化了，同時將在胃中不消化的天然的 β-乳球蛋白注射到小鼠胃內，這些天然的β-乳球蛋白進入小腸后也被消化了，這與體外結果也是一致的。這個實驗表明體外建立模型模擬蛋白質的消化可以較好的反應體內真實的消化狀況，將其作為蛋白質消化研究的方法和工具是可行的。

3.體外消化模型在活性寡肽研究中的應用

隨著生物活性寡肽研究的深入，關于活性肽的消化研究也逐步展開。攝入蛋白質不僅是人體需要的營養物質氨基酸的重要來源，還扮演著生物活性肽的重要角色，體外模型對活性肽消化和活性的評價已有應用的先例。目前報道較多的是消化模型應用于 ACE 酶抑制活性肽的研究。有研究者在體外用 pH 在 2～3 之間的胃蛋白酶液和 pH 在 7～8 之間的胰液素消化瑞士干酪[15]，結果發現經消化后的蛋白產物的 ACE酶抑制活性發生了變化。高分子量的蛋白質消化后會產生一些新的活性肽，加強對 ACE 酶的抑制，而原本具有一定 ACE 酶抑制作用的 10ku 的肽卻被消化了，這又降低了產物的 ACE 酶抑制活性，研究結果表明消化帶來的蛋白和肽的結構變化，將與其體外活性測定的結果有所差別，高活性的物質也許經過消化后，其活性中心被影響，導致活性降低，而低活性的物質，經過消化后也許活性片段將暴露，活性反而更高。因此，傳統的簡單的體外活性篩選不能完全反應它們在體內經消化后的活性狀況，結合消化模型對活性進行綜合評價是十分必要的。同類研究還有用胃蛋白酶-胰液素聯合消化大豆蛋白[10]或鰹魚[16]蛋白，研究其產物的 ACE 酶抑制活性。體外消化模型也有用于抗氧化肽研究的報道，我國學者王興等[17]人通過體外模擬部分胃、腸道消化過程，考察苦蕎蛋白經胃、腸道消化后生成肽的組成及其抗氧化活性，揭示了苦蕎蛋白質體內消化與抗氧化活性的關系。研究結果顯示苦蕎蛋白質經模擬消化 10h 后產生最高抗氧化活性多肽，凝膠分離出 5 個組分，其中分子質量為 900u 的肽具有最強的抗氧化活性。生物活性肽在人體內發揮著重要作用，活性肽進入人體后的消化產物是多樣的，只有能在體內環境下保留某些特征結構或者釋放特征結構的肽分子才會在人體內發揮重要功能。因而，采用體外消化模型進行活性肽的篩選和評價，不僅可以縮短研究時間，減少研究費用，同時也是更為準確和合理評價其活性所必需的，對于生物活性肽食品、藥品的開發有重要意義。

4.體外消化模型在過敏原研究中的應用

蛋白質體外消化模型還被應用于過敏原等對人體有重大潛在危害的蛋白或肽類物質的檢測中。如對獼猴桃過敏原[18]、鯉魚過敏原[16]的研究。一些研究者通過模擬腸胃液消化試驗，分析鋸緣青蟹肌肉中過敏原（原肌球蛋白）的消化特性以及消化對過敏蛋白致敏性的影響，結果表明蟹類過敏蛋白相對于非過敏蛋白具有較高的消化穩定性，而且其高分子質量降解產物仍可能引起過敏反應[19]。試驗采用模擬胃、腸液環境，以 SDS-PAGE 和Westernblot 進行分析，對青蟹原肌球蛋白和肌原纖維蛋白在體外模擬腸胃環境中的消化穩定性進行了測定。在模擬胃液反應中，非過敏原蛋白尤其是肌球蛋白重鏈和肌動蛋白可被胃蛋白酶快速降解，而過敏原蛋白原肌球蛋白在 60min 時仍未被完全分解。在模擬腸液反應中，相對于致敏蛋白，肌球蛋白重鏈、肌動蛋白等非過敏蛋白在較短的時間內被分解，原肌球蛋白盡管 120min 后幾乎被完全分解，但會產生一些較穩定的蛋白降解片段，而且其中一些分子質量為 34ku 的原肌球蛋白降解產物仍具有過敏原性。體外模型的應用為過敏原的研究提供了簡便實用的工具。除上述研究外，還有大量的應用體外消化模型對動植物蛋白進行研究的報道，如對海藻蛋白[20]、肌原纖維蛋白[21]、肉類蛋白[22]、抗高血壓三肽[23]以及其它動物副產品蛋白的研究。由此可見，作為應用較早的體外消化模型，蛋白質體外消化模型已經開始在蛋白質的各類研究中發揮重要作用。