非細胞型HBOCs的抗氧化研究

維持Hb的還原狀態是保證其能夠攜帶氧的前提條件，而維持其還原狀態則有賴于Hb所處環境中有較高濃度的還原劑，較低濃度的氧化劑。石曉東等研究發現，當對紅細胞裂解液進行微孔膜分離時，MetHb增加不多；但去除超氧化物歧化酶(SOD)等其他紅細胞蛋白后再進行超濾膜濃縮Hb，出現較多的MetHb，說明抗氧化劑的能有效地降低MetHb的生成。在Hb溶液中和制備Hb的超濾過程中，谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、亞硫酸鈉、維生素C都能保護Hb免被氧化[2]。無基質Hb（Stromafleehemoglobin,SFH）由于缺乏正常紅細胞所具有的還原酶系（如SOD、過氧化氫酶CAT、MetHb還原酶等），Hb內的Fe2+容易氧化成Fe3+形成MetHb而失去攜氧能力，并且還可產生自由基，尤其是在組織缺血再灌注時，可發生自由基的級聯反應，造成組織的過氧化損傷；同時Hb釋放的鐵離子能促進細菌的生長，可能引起膿毒癥等。因此，除了其他副作用和缺陷外，單從抗氧化的角度，SFH就不是理想的氧載體。

第一代HBOCs的研究主要是對Hb的化學修飾，主要包括Hb的分子內修飾（形成分子內交聯Hb）、表面修飾（形成共軛Hb）、分子內與分子間的雙重修飾（形成聚合Hb）等[3]。其主要目的穩定Hb的四聚體結構，增加分子量，延長半衰期；升高P50，降低Hb與氧的親和力，利于組織細胞獲得更多的氧。然而，這類修飾并沒有提高Hb的抗氧化能力[4]，有些修飾反而促進了MetHb的形成。如多聚交聯Hb的自氧化作用比未聚合交聯Hb顯著增強[5]；Sprung等[6]對55例手術患者在術中使用了不同劑量的HBOC-201(HemopureTM，Biopure公司生產的超純化的戊二醛多聚牛Hb電解質平衡溶液)，發現術后血漿MetHb呈劑量依賴性升高。O′HaraJF等[7]研究發現，HemAssistTM（DCLHb）在儲存過程中，會隨著時間和溫度的增加，MetHb含量也明顯增加。對大量失血患者使用大劑量的DCLHb治療過程中發現血漿MetHb有不同程度的增加。盡管在這些研究中MetHb的增加在動物實驗和初期臨床試驗中并沒有引起明顯的并發癥，但是對患有嚴重疾病，尤其是危重病如多器官功能障礙綜合癥、缺血再灌注損傷等患者，由于復雜的病理生理環境（如自由基增加，過氧化狀態，炎性介質的釋放等）可能會加重病情或引起嚴重的并發癥。

為了克服非細胞型HBOCs的自氧化缺陷，國內外學者開始了第二代HBOCs的研發，即在多聚的血紅蛋白上交聯抗氧化劑如SOD、CAT、硝基氧、GSH、水溶性維生素E類似物等，使多聚Hb具有抗氧化性。Chang等利用研發的交聯SOD和CAT的聚合牛Hb（即PolyHb-SOD-CAT）對大鼠進行缺血再灌注研究，發現PolyHb-SOD-CAT對大鼠肝、腎再灌注具有較強的抗氧化性[8,9]。Powanda等[10]利用大鼠球形腦缺血再灌注模型，觀察PolyHb-SOD-CAT的效果時，未發現明顯的由氧自由基引發的再灌注損傷。我國楊懿銘等[11]采用戊二醛交聯法制備的抗氧化酶交聯的多聚Hb即PolyHb-SOD-CAT，測定不同溫度、時間保存下制品MetHb的變化，發現在4℃、24℃不同保存時間均呈自氧化穩定，37℃、8小時顯示比多聚Hb有更強的自氧化穩定性。說明交聯了SOD、CAT的多聚Hb具有了抗氧化性，在一定程度上減輕了活性氧自由基的產生,并能抑制多聚Hb制備過程中MetHb的形成,減少Fe3+及血紅素的析出。

以基因重組方法生產重組人Hb也是開發HBOCs的重要途徑，Hoffman等[12]將Hb的α和β基因構建于同一表達載體，使α和β亞基在表達過程中即形成α2β2四聚體。由此可以想象，將抗氧化劑如MetHb還原酶、SOD和（或）CAT的基因與Hb的α和β基因構建于同一表達載體，將可能生產出具有較強抗氧化性的Hb。也有研究發現，人Hb的α鏈上酪氨酸Y-42位是血紅素產生自由基的關鍵部位[13]，可以用無反應活性的氨基酸取代Y-42位，認為可以有效減少氧自由基的產生。因此，重組蛋白工程也是阻止HBOCs被氧化的有效途徑之一。

細胞型HBOCs的抗氧化研究

細胞型HBOCs是第三代血液代用品，主要特點是在Hb的外面用膜包覆，在結構上接近紅細胞。早期的人工紅細胞是用一薄層有機酯包裹Hb、2，3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）、CAT和碳酸酐酶等。由于半衰期非常短、毒性大，又發展了用脂質體為材料的亞微米人工紅細胞——脂質體包埋Hb，并進行了脂質體表面修飾，雖然半衰期明顯延長，但MetHb的生成明顯增加。為了減少MetHb生成以及其他副作用的產生，國內外學者把研究重點轉移到生物降解納米材料包裹Hb的研發上。如聚交酯或聚乙醇酸交酯包裹Hb的納米級人工紅細胞，同時加入MetHb還原酶等酶類。這種生物可降解聚合物包膜可以使外部的葡萄糖和還原酶進入微囊，而反應產物也可透過此膜到囊外，從而避免反應產物對還原反應的抑制。Chang等[14]曾研究出聚乙烯乙二醇-聚交酯包囊包裹了紅細胞內全部酶類的納米級人工紅細胞，輸注大鼠后血漿中半衰期為24.2小時，在人體有可能達到41.5小時；如果將其重懸于100mg/dl葡萄糖和0.02mM輔酶I(NADH)的乳酸林格液中，5小時后MetHb含量下降到1.5%，說明該包囊還能利用外液體環境中的還原劑有效地還原MetHb。SakaiH等[15]研制出的聚乙二醇修飾的脂質體包被的血紅蛋白微囊，正在進行臨床試驗前的安全和效能評估。我國章曉蘭等[16]研究制備了表面孔徑可調的載牛血紅蛋白(bovinehemoglobin，BHb)納米微球型血液代用品，并且建立了一套兩步還原及過程優化的非酶還原系統控制其中的MetHb含量。通過兩步還原及過程控制，MetHb在原料中的含量從90％以上降為1.25％，接近天然血液中MetHb含量，具備攜氧／釋氧功能。同時，由于微球的膜是可調孔徑的多孔結構，進入體內后，血漿中的還原成分可透過微球膜進入其中，可進一步抑制MetHb的生成。這為建立人工紅細胞內的還原酶體系奠定了基礎。

近年來，利用生物降解聚合物作為Hb載體的研究越來越受到了國內外學者的青睞。國際上如日本Tsuchida小組和美國Rudolph小組等，在利用生物可降解的聚乳酸（PLA）、聚乳酸乙醇酸（PLGA）等高分子材料開發包含Hb、紅細胞各種酶類如SOD、MetHb還原酶在內的納米微囊。我國中國科學院黃宇彬等工作者利用可降解納米膠束（膠囊）技術合成了兩親性的PEG-MPC-PLA嵌段共聚物，在其膠束的憎水核的表面利用click反應鍵合了Hb，實驗證明該聚合物不僅具有良好的氧合和解離功能，而且表面的PEG鏈段在水溶液中能自由伸展，可以有效地防止Hb被氧化和免疫系統攻擊。同時，他們還合成了兩親性氨基酸共聚物聚賴氨酸-聚苯丙氨酸（PLL-b-PPA)，可以在水中形成一種包裹Hb的微米級囊泡。這不僅可以保證Hb的攜氧功能，而且可以有效地保護Hb免受環境中氧化劑的攻擊[17,18,19]，也可以將MetHb還原酶等酶類包裹其中，確保Hb不被氧化。王翔等[20,21]基于紅細胞力學特性、結構特點與攜氧功能的關系,研發了一種與天然紅細胞在形態、功能、結構上相似的人工紅細胞，重建的人工紅細胞具有正常紅細胞的攜氧和釋氧能力，并包含了正常紅細胞具有的還原酶類，能夠有效地防止Hb被氧化。