1蠶各發育階段蛋白資源的研究應用

1.1蠶卵及幼蟲

蠶卵中含有蛋白質、粗脂肪、還原糖、維生素及輔酶等活性物質，其氨基酸組成與桑葉大體相同。以蠶卵為原料研制的胚胎素可治療婦科疾病[5]。蠶幼蟲體內也含有大量的蛋白質。其中，甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸的含量占總量的43%，苯丙氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸的含量較低，僅占氨基酸總量的6%左右。全蠶粉是比較成功的上市產品，營養價值高，且具有降血糖功效[6]，以蠶蛋白質為來源開發抗菌肽是活性肽研究的熱點領域。抗菌蛋白和抗菌肽能直接殺滅細菌及其他致病病原體，且具有良好的熱穩定性，在食品加工中仍能保持良好的活性，被公認為最有應用前景的防腐劑和保健劑。在番茄汁加工中應用新疆家蠶抗菌肽可降低番茄汁的殺菌強度，提高產品品質[7]。家蠶癱瘓肽（paralyticpeptide）由23個氨基酸殘基組成，是一種具有生長攔截、麻痹和促進漿細胞擴張等功能的生物活性肽。向幼蟲中注射家蠶癱瘓肽，能快速產生強烈的麻痹作用[8]。Kazunori[9]等研究發現，該類癱瘓肽（paralyticpeptide）三級結構的差異對漿細胞擴張活性影響較小，但可以引起生長阻滯活性不同。神經肽是一種能夠調節多種動態平衡和指導激素、神經或神經遞質發揮作用的生物活性肽。Yukihiro等制備抑制家蠶產生滯育激素的抗體，通過免疫細胞化學反應，將抗原定位在家蠶的中樞神經系統中，在神經中樞和腦中可以觀察到免疫反應的胞體。滯育性幼蟲的陰唇神經節神經細胞能夠釋放神經肽（FXPRLamide），使免疫反應顯著性降低。腦，胸及腹腔分泌的神經肽可能作為神經遞質或者神經節[10]。Hirotoshi[11]等應用PCR聚合酶鏈式反應，在家蠶中cDNA克隆甲殼動物高血糖激素家族肽（CHH），然后從擴增產物中分離出一種cDNA，命名為BmCHHL，該產物有110個氨基酸的開放式閱讀框架。序列分析表明這種肽含有72個氨基酸，并在羧基端酰胺化。BmCHHL序列與CHH家族非常相似，在5齡第4d幼蟲的5或6個大腦細胞半球的正面可檢測到BmCHHL的表達。家蠶肽（Bombyxin）是一種與胰島素相關的肽，對碳水化合物代謝具有一定的調節作用，淋巴海藻糖是昆蟲碳水化合物的一種貯存形式。向頸扎節幼蟲注射家蠶肽，可以提高腸和肌肉中海藻酶的活性，并通過促進水解淋巴海藻糖成為葡萄糖，降低淋巴糖、海藻糖的濃度。此外，家蠶肽還可降低脂肪組織中的葡萄糖含量，同時提高組織中活性糖原磷酸氧化酶的百分比，降低家蠶幼蟲中存儲的主要碳水化合物的數量。盡管家蠶肽能夠像胰島素一樣控制碳水化合物代謝，但是其在昆蟲體內發揮的生理功能與胰島素在哺乳動物體內的生理功能不相同，有待進一步研究[12]。

1.2蠶蛹

蠶蛹是繅絲工業的主要副產品，營養豐富，但是丟棄量較大[13]。干蠶蛹蛋白質含量為45%~50%，脫脂蠶蛹的蛋白質含量高達77%。蠶蛹蛋白含18種氨基酸，并且富含核黃素、尼克酸、鋅、鐵、銅等[14]。蠶蛹中8種人體必需氨基酸的含量在40%以上，且氨基酸組成均勻，被稱為“優質的昆蟲食品”[4，15-16]。從蠶蛹中提取蛋白質并對所得蛋白質和水解氨基酸加以利用已經成為食品、醫藥等領域的研究熱點。蠶蛹蛋白粉可以作為食品添加劑或者營養強化劑，應用于口服液、飲料、蠶蛹精油、餅干、罐頭、奶、酒、蠶蛹補酒、米糊等，也可作為飼料蛋白，其蛋白質含量高于國產和進口的魚粉。陜西紫陽縣蠶蛹中硒的含量為普通蠶蛹硒含量的215倍，富硒蠶蛹氨基酸在0.5、1.5、2.5μmol•L-1硒濃度下能顯著性抑制肝癌細胞（SMMC-7721）生長，誘導SMMC-7721細胞凋亡[13]。蠶蛹復合氨基酸具有促進蛋白質合成、增進造血等功能，可用于治療惡性腫瘤、慢性消耗性疾病引起的營養不良、低蛋白血癥、免疫功能低下等病癥。以蠶蛹復合氨基酸為主要原料研制而成的中藥舒樂康膠囊等，均已正式投產[17]。周菊香等[18]研究表明，蠶蛹多肽對高膽固醇患者有明顯的降低血清膽固醇作用，對膽固醇正常者無明顯影響；同時能提高SOD酶活性并具有抗脂質過氧化作用。酶膜耦合法分離制備的蠶蛹生物活性肽可促進生物體丙酮酸的生成，對糖的正常代謝起到積極作用[19]。洪奇華等將蠶蛹蛋白酶解肽添加于斷乳仔豬日糧中，表明蠶蛹蛋白酶解肽能明顯提高斷奶仔豬日增重，降低料重比和腹瀉率，可以提高斷奶后仔豬血清堿性磷酸酶和血清鐵含量，顯著提高十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度并降低十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度，顯著提高空腸黏膜蔗糖酶和麥芽糖酶活性[20]。許玉澄等從家蠶蛹血淋巴中分離到一種活性肽，該活性肽能明顯抑制S180荷瘤小鼠瘤重，但對外周血白細胞數無影響。病理切片顯示，注射活性肽S180荷瘤小鼠癌瘤組織大面積壞死，艾氏腹水瘤（EAC）腹水生成量減少[21]。本實驗室以陜西安康百瑞絲綢有限公司的蠶蛹為原料，優化蠶蛹蛋白的提取工藝，采用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解蠶蛹蛋白，以水解度和清除DPPH•能力為指標對酶解過程進行分析，并研究了水解產物的體外抗氧化活性。結果表明，堿性蛋白酶對蠶蛹蛋白具有較好的水解效果，其水解產物有較高抗氧化活性，對DPPH•、超氧陰離子自由基（O2-•）和羥自由基（•OH）都具有較強的清除能力[4]。在此基礎上，進一步比較單酶和復合酶水解效率并探究酶解多肽的其他活性，如抑菌、降糖、降壓、抗病毒等，制備高純度活性多肽。應用食品毒理學和營養學原理，篩選非營養型甜味劑、酸味劑等添加劑，優化蠶蛹氨基酸口服液制備工藝，構建動物模型，深入研究該產品的安全性、營養價值以及功能性成分的作用機理，為工業化生產提供參考。

1.3蠶蛾

早在唐宋時期，蠶蛾就被視為皇室的珍貴補品，有“神蟲國寶”之稱。蠶蛾體內含有豐富的蛋白質激素、細胞色素C、維生素B2等成分，具有增強人體免疫力和調節人體機能的作用[22]。蠶蛾蛋白是一種氨基酸組成較齊全、必需氨基酸比例較高的純天然動物性蛋白質。迄今，我國已經開發出了一系列蠶蛾食品，如復合雄蠶蛾荔枝汁運動飲料[23]、雄蠶蛾醋[22]、蠶蛾軟罐頭[24]等。以蠶蛾為原料開發出的藥品有“延生護寶液”、“九如天寶液”、“艷天陽”維力康膠囊[25]和“龍蛾丸”強精補藥等。桑蠶雄蛾酒具有滋補壯陽的功效，并且安全性較高[26]。功能性成分測試結果表明，雄蠶蛾酒（雄蠶圣酒）和蠶粉復合物（雪蠶膠囊）氨基酸含量分別為577.10mg/L和537.10mg/L，必需氨基酸分別占氨基酸總量的41.96%和43.28%，符合聯合國FAO/WHO提供蛋白模式值和天然綠色保健食品及特殊營養食品的國際質量標準[27]。

2蠶絲蛋白資源的研究應用

蠶絲由絲素、絲膠、絲蠟、糖、色素以及無機物組成，是高級的傳統紡織原料，被譽為“纖維皇后”。我國生絲產量占世界總產量的65%[29]。絲素、絲膠是蠶絲的主要蛋白質，分別占蠶絲蛋白總重量的70%～80%和20%～30%。蠶絲內層為絲素蛋白（silkfibroin），外層被絲膠蛋白（sericin）包覆[30]。絲膠是球狀蛋白質，水溶性較好。絲素是纖維狀蛋白質，難溶于水。蠶絲中的主要氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸等，約占蠶絲氨基酸總量的85%。

2.1絲膠蛋白

絲膠蛋白中含羥基、羧基、氨基等極性基團的氨基酸約占氨基酸總量的70%，必需氨基酸含量高達17%以上。絲膠蛋白能夠促進Zn、Fe、Ca、Mg等的吸收，其中絲氨酸和蘇氨酸可以與微量元素（如銅和鐵）絡合，抑制多酚氧化酶的活性，具有抗氧化功能[30]，可以防止紫外線損傷和抑制腫瘤增殖[31]。絲膠和絲膠肽具有冷凍保護作用，可防止食品、組織和細胞冷凍變性或者用于研制抗凍生物材料[32]。絲膠肽也可作為食品添加劑，如絲膠水解液作為話梅的浸漬調味液和冰凍糕點的良好成形劑等[33]。絲膠蛋白具有生物降解性，是良好的傷口愈合劑[34]和藥物緩釋材料[35]。絲膠及其水解物有助于胰島細胞繁殖[36]，能有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖，預防糖尿病神經病變；改善大鼠的生精功能[37-39]。此外，絲膠蛋白還具有解酒保肝功能[40]。絲膠及其水解物在化妝品行業也有廣闊的應用前景。胡桂燕等探究了絲膠蛋白液的護膚功能，并研制對紫外線具有吸收作用的絲膠美白防曬乳[41-42]。

2.2絲素蛋白

絲素蛋白由18種氨基酸組成，其中85%左右為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸，其特征氨基酸帶有氨基（-NH2）和羧基（-COOH），具有兩性電解質的性質。絲素蛋白的構象以穩定的反平行β-折疊構象為基礎，具有良好的機械性能（如柔韌性和抗拉伸強度）、理化性質（如透氣透濕性、緩釋性）和良好的生物相溶性和生物降解性，已應用于人工皮膚等仿生材料、酶的固定材料、生物傳感器材料、組織工程材料[43]等方面。絲素蛋白具有防治高血壓[44]、抗基因毒性[45]等多種藥理作用。FENGJUANZHOU等通過堿性蛋白酶水解并分離純化制備具有抗ACE活性的絲素多肽，并通過高效液相-電噴霧串聯質譜測定有效結構為Gly-Tyr[46]。柞蠶絲素粉與鳥氨酸的混合物能明顯降低小鼠的肝體比和血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白的濃度，提高高密度脂蛋白濃度，可有效預防酒精性脂肪肝的發生[47]。絲素蛋白在食品領域中的應用十分廣泛。含有絲素蛋白粉和絲肽的食品添加劑不僅能部分補充氨基酸，還能促進Zn、Fe、Mg、Ca等礦質元素的吸收。目前，市場上已經有絲肽功能性飲料[48]、絲肽口嚼片，絲素果糖、果凍、餅干和醬油等[49]。絲素具有良好的起泡性、乳化性和凝膠性，將絲素添加到蛋糕中，可以產生較小且較均勻的氣孔，增強蛋糕感官品質和商品價值[50]。絲素蛋白與人體皮膚具有良好的親和性，有助于調節水分，防止太陽輻射。李莉將絲素肽與中草藥復配研制的洗發香波，具有明顯的去屑止癢功效[51]。絲素蛋白也是紡織工業的重要原材料，目前主要的開發研究方向有絲素蛋白棉/毛織物面料、生態合纖織物面料和生態復合面料等[29]。

3蠶蛋白類激素與酶的研究應用

蠶的生長發育受到多種激素和酶的調控，各種激素和酶的生理功能不同，具有潛在的開發價值或用途。

3.1激素

蠶屬于全變態昆蟲，是鱗翅目昆蟲的代表生物，在昆蟲的進化、生長發育和害蟲防治等研究領域都有著不可替代的優勢。蠶的蛻皮由促前胸腺激素（prothoracotroPichormone，PTTH）、蛻皮激素和保幼激素共同組成的內分泌調節系統控制。促前胸腺激素，又稱腦激素，屬蛋白或肽類化合物，具有活化咽側體及前胸腺的功能，對卵巢的發育及昆蟲的滯育也有控制作用[52]。滯育激素是一種神經肽激素，從咽下神經處分離得到，可誘導蠶胚胎滯育。家蠶滯育激素的生物反應核心是C端五肽酰胺，最大可誘導11%滯育卵。大約70%滯育卵的生物反應在C端六肽酰胺處表達，該處ED50值比母體分子的高1000倍。肽鏈的N端串行伸長引起Arg9-Gly10和Thr1-Asp2兩處ED50值顯著降低。N端母體分子或片斷的中部有一些重復序列，刪除這些序列能夠增加分子的ED50值，但是對生物反應沒有影響。因此，N端區域和重復序列是互補結構[53]，共同調節滯育激素。Okitsugu[54]研究了家蠶滯育激素的結構、基因表達和功能。滯育激素的信息激素合成肽（DH-PBAN）基因由6個外顯子和5個內含子組成，在咽下的12個神經分泌細胞中表達。25℃下，可促進后代的早期滯育，引起生活周期5個不同階段DH-PBANmRNA含量增加，15℃下可誘導蛻裂成熟期基因表達。DH-PBAN基因能夠刺激各個發育卵中海藻多糖酶活性。體內和體外實驗表明，DH明顯誘導發育卵中海藻糖酶的表達，溫度是導致滯育誘導的先決條件，且Ca2+依賴蛋白激酶不可或缺。桂仲爭等發現全蠶粉中含有甲狀腺激素類似物-T3（L-3，5，3’-三碘甲腺原氨酸），可抑制小腸粘膜麥芽糖苷酶活性，具有顯著的降血糖效果[55]。

3.2酶

超氧化物歧化酶在食品和化妝品工業中具有廣泛用途。KohjiYamamoto等通過逆轉錄聚合酶鏈式反應，cDNA編碼家蠶含錳超氧化物歧化酶（MnSOD）。通過酵母菌擴大培養，并分離純化所得的MnSOD可促進超氧化物陰離子還原反應。在4℃，pH4~11條件下放置24h和pH6.8，低于50℃條件下放置30min，該酶的殘余活性均大于原活性的75%[56]。溶繭酶是蠶蛾在羽化過程中分泌的一種酶，具有軟化和溶解繭的作用。溶繭酶對多種蛋白質（纖維蛋白、絲膠、明膠蛋白等）具有水解活性，基本性質與胰蛋白酶相似，對精氨酸和賴氨酸類具有特殊活性。溶繭酶具有強烈的纖溶酶活力，可用于水解蠶絲制備生物活性多肽，研制新型治療血栓疾病的藥物以及裂解絲素開發純天然無副作用的新型化妝品[57]。

4蠶蛋白質資源的安全性

目前，有關蠶蛋白質資源安全性的研究較少。Jun等[15]系統地評價了柞蠶（Antheraeapernyi）蛹蛋白的安全性。急性毒性實驗顯示，小鼠對蠶蛹蛋白的最大耐受劑量>15.0g/kg體重，根據急性毒性實驗的分類標準，表明蠶蛹蛋白沒有毒性；Ames實驗、小鼠骨髓微核實驗和精子致畸實驗結果陰性，表明蠶蛹蛋白沒有誘變毒性；30d喂養實驗顯示：按照0.30、0.75、1.50g（/kg•d）的劑量給藥30d，小鼠未出現死亡或者血液、臨床化學和組織病理學等異常臨床表現，小鼠在體重、食物的消化和吸收功能上沒有顯著差別。對于小鼠，蠶蛹蛋白的最大安全劑量為1.50g/（kg•d）。

5展望

蛋白質是重要的營養素，在食品工業中具有廣泛用途。拓展蛋白質資源、開發新型蛋白質產品是蛋白質科學研究的重要分支之一。研究蠶蛋白質資源的開發利用，不僅對解決蛋白質資源匱乏有重要的參考價值，而且對食品工業以及蠶絲業的發展具有積極的推進作用。目前，在氨基酸開發利用領域，國內外研究主要集中于蠶蛋白質、氨基酸種類和含量分析，對營養學、安全性研究尚較單薄。譬如，以蠶蛾為主要成分的保健食品很多，但是對其作用機制及其物質基礎的研究卻很鮮見。安全性是食品研究與開發的首要問題。在對蠶蛹、蠶蛾的氨基酸資源進行研究開發過程中，必須運用現代營養學、毒理學等原理對其安全性進行分析。特別是某些采用酶降解技術制備的氨基酸，由于其中引入了生物制品（酶），因此酶的滅活、去除及其安全性研究顯得尤為重要。在蠶活性肽開發利用領域，安全性也是需要解決的關鍵問題。此外，應當加強對生物活性肽構效關系的研究，揭示其作用機制。大量實驗表明，除了必須具備特定的一級結構外，活性肽生物活性的發揮還需具有一定的空間結構（如卷曲、環形、α-螺旋、β-折疊等）。測定蠶生物活性肽的一級結構和高級結構，闡明活性肽的構效關系，對于揭示活性肽作用機制以及新型活性肽的設計均具有重要的理論意義。在蠶生物活性肽制備領域，由于蠶蛋白質水解產物為多肽混合物，其中某些短肽的氨基酸結構和分子量相近，但功能性差異很大，分離和提純難度很大。在不影響多肽產品組分結構和分離效果的前提下，簡化分離過程，提高分離、純化效率，防止產物發生腐敗變質，實現高通量分離，也成為分離工作者需要解決的問題。