本文作者：胡東維、王疏 單位：浙江大學生物技術研究所水稻生物學國家重點實驗室、遼寧省農業科學院植物保護研究所

稻曲病菌的分類地位和基本生物學性狀

稻曲病菌最早是Cooke對采自印度標樣研究的基礎上，將其命名為UstilagovirensCooke，即黑粉菌屬一個種；隨后Patouillard對來自于日本稻曲病標樣進行了獨立研究，將其命名為TilletiaoryzaePat.，即稻腥黑粉菌屬一個種；1895年Brefeld認為TilletiaoryzaePat.的發育與產孢模式類似于狗尾草上的一種無性階段，叫做Ustilaginoidea（綠核菌）屬的子囊菌，因此將稻曲病菌劃歸到Ustilaginoidea屬中，更名為U.oryzae（Pat.）Brefeld[1-2]。直到1934年Sakurai才發現了該病原菌的有性孢子，即菌核萌發產生子囊孢子，從此該菌被歸于子囊菌的麥角菌屬（Claviceps），但因一系列原因未獲得有效命名。直到2008年Tanaka在比較研究的基礎上將其從麥角菌屬中獨立出來，將其有性態定名為Villosiclavavirens[2]。

稻曲病的癥狀只出現在水稻的穗部，只在個別小花上產生黃色至深綠色的球狀病原菌菌落。此前水稻植株的葉片、莖稈等部位沒有任何異常癥狀。在田間自然條件下，一般在水稻開花后1周左右開始有幼嫩的稻曲球出現，開花3周后稻曲球體積達到最大并在其外圍產生大量的厚垣孢子[1]。在一定環境條件下，在水稻成熟晚期稻曲球的表面可形成一至數個形狀不規則的菌核，菌核可在一定條件下萌發產生子囊孢子[2,13-14]。稻曲病菌在各種固體培養基上生長十分緩慢，長滿一個9cm直徑的培養皿至少需要25—30d。在培養14d后可開始產生少量薄壁的分生孢子，培養約20d后可開始產生厚垣孢子；在液體培養基中，稻曲病菌只產生橢圓形的、薄壁的分生孢子；厚垣孢子萌發分生孢子，但厚垣孢子在室內條件下保存會很快喪失其萌發能力[15-16]。稻曲病菌的菌核可萌發進行有性生殖并產生子囊孢子，子囊孢子萌發則產生類似于液體培養產生的薄壁分生孢子[17]。厚垣孢子和子囊孢子萌發后最終都會形成薄壁小孢子[17]。稻曲病菌菌核在來年春季需2個月以上的時間方可萌發產生子囊孢子。大部分的菌核在稻田環境條件下難以越冬并成為來年的主要初侵染源[13]。

稻曲病菌對水稻幼苗的侵染

早在20世紀60年代，Ikegami就對稻曲病菌的苗期侵染進行了組織學研究。結果發現，稻曲病菌可以成功侵染水稻萌發初期的幼嫩胚芽鞘，并沿著韌皮部中的篩管外表面進行擴展，直至分蘗的中晚期；但并沒有發現稻曲病菌能夠像黑粉菌那樣抵達植株莖尖部的穗原基[18-19]。鄭大偉等發現，稻曲病菌菌絲在侵染點處稍稍膨大，形成類似于附著胞結構，然后侵入水稻胚芽鞘表皮細胞的角質層下生長，繼而以胞外擴展的方式進入組織深層（圖1）[20]。稻曲病菌不能成功侵入水稻葉片，也沒有檢測到能夠侵入根部。但在后續幾年的田間試驗中，苗期成功接種的幼苗，在田間條件下并未發病。需要指出，2009—2011年中國稻曲病僅零星發生，是否存在大氣候環境的影響，則尚未明確。Ditmore等近年來也對稻曲病菌的苗期侵染進行了研究。細胞學觀察發現稻曲病菌可侵染水稻幼嫩的胚根；同時PCR檢測表明病原菌可擴展至整個植株包括穗和籽粒[21-23]。

中國許多學者多年來對水稻種子帶菌是否可導致水稻發病問題做了大量的田間比較研究，部分結果表明種子帶菌可導致水稻發病[24-25]，而一些研究結果則相反[26]。也有試驗表明苗期和抽穗期均可成功侵染[27]。分析這些結果，其共同點均是最終病穗率都比較低，遠遠低于高發病年份高感品種田間自然發病率，因此需要更多年份的試驗來驗證。此外，缺乏帶有特殊標記的稻曲病菌菌株，也使得上述研究是否真正誘發侵染仍存質疑。Tang等采集了田間自然發病的病粒數高的重病穗，然后對其穗軸和稻曲球下的小穗軸進行了細胞學觀察，沒有發現病菌菌絲的存在，說明所檢測的稻曲球是病原菌穗部局部侵染導致[28]，從一個側面說明稻曲病菌在苗期侵染后，在自然條件下很難或不能有效擴展到穗部并引發病害。

水稻孕穗期稻曲病菌的侵染

稻曲球是稻曲病的唯一可見癥狀，因此大部分學者認為稻曲病菌的侵染應該在孕穗或開花期。國內外大量的穗部接種試驗表明，孕穗期接種能夠大幅度提高水稻的發病率，其中一些新的注射接種方法可以使病穗率達到100%，單穗病粒數也比較高[29-32]。對于稻曲球發育過程早在100年前就有了簡單的觀察和描述，認為稻曲病菌的侵染可分為明顯不同的2個時期，即在小花發育的早期和籽粒成熟后期，其中早期侵染導致子房破壞，但花藥和柱頭仍保持完整；而后期侵染可導致部分或所有胚乳被菌絲取代[1]。王國良對稻曲球的發育過程進行了系統、細致的解剖觀察，發現孕穗早期水稻小花柱頭和子房上有大量菌絲的積累，由此推斷病菌應是從水稻的柱頭侵入的，侵入后由子房、柱頭提供營養，迅速向花藥及整個穎花內腔發展蔓延，最后形成稻曲病菌厚垣孢子球[33]。劉水芳等也得到了類似的結論[34-35]。蔡洪生等利用人工接種方法，發現稻曲病菌菌絲最先出現在花絲和花藥上，后來才出現在柱頭上[36]。但上述研究均沒有嚴格的組織病理學觀察，沒有在組織或細胞內部檢測是否存在病原菌。

Tang等利用人工接種方法，挑取早期侵染的小花，然后對整個小花進行固定和樹脂包埋，繼而對整個小花的連續半薄切片進行觀察，同時對重點部位進行定位和超薄切片觀察[28]。結果發現，稻曲病的初侵染位點是水稻的花絲組織，并最易侵染位于子房和漿片之間的3個花絲（圖2）。連續切片的分析結果也表明，稻曲病菌從不侵染水稻子房和花藥，但偶爾會有次生菌絲侵染柱頭和漿片的外圍組織。病原菌侵染模式屬于細胞外侵染和擴展，病原菌菌絲不直接穿透和進入寄主細胞，只在細胞間穿行，并最終將花絲組織的細胞壁完全降解。在稻曲球發育過程中，稻曲病菌雖然產生毒素但并不殺死寄主細胞，因此稻曲病菌屬活體營養型病原菌[28]。這在機制上與一般的活體營養型及死體營養型病原菌均有所不同[37]，比較少見。張震等也指出雜交水稻的不育系比較感病[35]。這說明不同水稻品種的花絲可能在發育和結構等方面存在差異。到目前為止，幾乎所有對新鮮稻曲球的解剖都表明，稻曲球內含有6個水稻花藥[28,33,35,38]。加之稻曲病菌不能侵染幼嫩的子房，所以侵染成熟籽粒的可能性更小。至今還沒有組織學和超微結構的證據證明稻曲病菌能夠侵染幼嫩的或成熟的水稻籽粒。

病原菌孢子萌發特性與水稻發育的時空關系

除了細胞學對侵染過程的檢測外，探討病原菌產孢類型、孢子萌發習性以及水稻發育時期，對于制定侵染機制研究的策略與途徑有非常重要的幫助。稻曲球外層是大量的厚垣孢子，厚垣孢子萌發后可產生數個薄壁的小孢子，這些小孢子可用于接種和侵染水稻[1,3-4,39]。但是厚垣孢子在室內條件下的存活能力非常有限，并在1個月后大部分孢子失去萌發能力[16]。因此，水稻產區當地的厚垣孢子只適合作為水稻苗期的初侵染源。當然，早熟水稻產生的厚垣孢子也可以作為晚熟水稻的侵染源。同樣，通過大氣長距離傳播，早熟稻區的厚垣孢子也可以侵染晚熟稻區的水稻。

在自然狀態下稻曲球上往往會產生菌核，成熟的菌核往往能夠存活一至數年。但對于子囊孢子致病性和菌核在中國的分布等情況的研究還很缺乏[4,13]。有研究表明，菌核在田間的萌發往往需要數月的時間，萌發后所產生子囊孢子的時期與東北、四川等地水稻孕穗期比較接近，因此可能是適宜的初侵染源[13]。目前對于稻曲病菌菌核的研究也相對較少。云南、四川、貴州、東北、西北等溫差較大地區菌核比較常見，而長江中下游地區、華南和福建相對較少。其實至少在長江中下游地區菌核也普遍存在，只不過往往發生在晚熟的品種上，采集和調查最好在水稻收獲前的數天進行；田間調查的時間太早會得出菌核缺失的假象。印度學者的研究也發現，稻曲病菌菌核多出現在高海拔地區[14]，也說明低溫或較大的晝夜溫差有利于菌核的形成。進一步研究不同稻區菌核產生的多少及其成熟度、菌核在自然條件下的存活率與萌發過程，對于確定它能否作為主要初侵染源至關重要。

稻曲病菌中間寄主

另外一個問題是，是否存在稻曲病菌的中間寄主及其在病害循環中的作用。Shetty等發現旱黍草上發現類似稻曲球的病原菌，將水稻和旱黍草上2個不同來源的病原菌交叉接種可致病[40]。Atia則報道在埃及發現稗草和白茅2種雜草可感染稻曲病[7]。中國黎毓干等報道在鼠尾粟上發現了類似稻曲病的病粒[41]。在中國很多地區的稻田都有人發現過帶有類似癥狀的雜草，但由于研究手段的限制，這些研究或未進行病原菌分離，或未進行分子生物學的驗證。另外，就其普遍程度來說，這類雜草被感染的情況是比較罕見的，因此對稻曲病菌初侵染的貢獻估計不會很大。

問題與展望

從現有的證據來看，稻曲病菌孕穗期侵染無疑是一種主要侵染方式。但是厚垣孢子還是子囊孢子作為主要初侵染源尚不清楚。其中子囊孢子的產生和萌發試驗在方法上尚存在一些困難。對稻曲病重災區的菌核產生情況以及子囊孢子的致病性研究應是未來研究的重要方向。

對于病原菌苗期侵染及其擴展問題，首先要有適當的帶有特殊標記的菌株、病原菌原位檢測的方法和建立一整套適宜水稻發病的栽培管理措施。Wang等分離到一個致病性良好的白化菌株，為苗期侵染的觀察提供了直觀的標記[42]。另外，日本[43]及中國浙江大學、西北農林科技大學、江蘇省農業科學院、浙江省農業科學院等多家實驗室均通過遺傳轉化得到了帶GFP標記的菌株；但帶有GFP菌株的穩定性和致病性尚待觀察，目前發現轉化菌株中GFP丟失現象很常見。此外，王永強等的研究發現，中國稻曲病菌的rDNA-IGS序列分為6種長度類型，其中＞96%稻曲球均為400bp的常見型，另外5類型為稀有型[44]（其中一罕見類型未發表，GenBank登錄號為JN036608）；用這些稀有型菌株進行苗期接種，并使用對植株的整個生長過程中的不同器官和最終植株上產生的稻曲球進行rDNA-IGS序列長度多態性的PCR檢測，就能夠有效避免田間稻曲病菌孢子對分子檢測的干擾，客觀了解稻曲病菌在水稻體內的擴展過程。

從技術層面來講，完整的細胞學證據鏈是澄清侵染機制必不可少的。Sesma等也正是這樣證實了稻瘟病菌具有系統性侵染的能力[45]。Zhou等建立了高靈敏度針對稻曲病菌的嵌套PCR方法[46]；但rDNA在基因組中重復次數較多，以其序列特征為基礎的PCR檢測難以完全排除植株表面病原菌孢子的干擾。所以篩選更多帶有特異性分子標記的菌株至關重要。對于細胞學檢測來說，由于稻曲病菌菌絲特別纖細，在光學顯微鏡下單條菌絲在切片上往往不易捕捉，因此超微結構分析是必不可少的。選擇遺傳穩定、產孢量高、致病性強的GFP轉化菌株，利用激光共聚焦顯微鏡進行活體、連續跟蹤研究，是研究苗期侵染的理想方法。

目前已經明確了稻曲病菌在穗部選擇性侵染水稻花絲，下一步研究的焦點則應是侵染的生化機制。首先是為什么病原菌會選擇性的侵染水稻花絲組織？花絲的結構發育和特定敏感時期的結構特征、花絲表面物質成分、病原菌胞間侵染的細胞壁降解酶、病原菌從花絲獲取營養的機制、雜交水稻花絲敏感的原因與水稻抗病性改良途徑等將需要逐一進行探討。在這方面，稻曲病菌的近緣病原真菌－麥角菌已有較好的研究積累[47-54]，可為稻曲病菌侵染機制的研究提供借鑒。此外，植物內生真菌與寄主互作機制的研究方法，也可以加以利用[55]。