1實驗材料、儀器和試劑

1．1實驗試劑

乳酸發酵菌種:植物乳桿菌;發酵液500mL;電極室用水:0．3mol/L的Na2SO4溶液1000mL(陰極室和陽極室各500mL);酸室和堿室為蒸餾水。發酵培養基每升含:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖50g、乙酸鈉2g、檸檬酸二胺2g、吐溫-801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0．2g、一水硫酸錳0．05g。

1．2實驗儀器

恒溫振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、發酵罐、干燥箱、電子天平、pH計、生物傳感分析儀、分光光度計、冰柜。其他常規實驗器皿:燒杯、量筒、玻璃棒、酒精燈、接種環、培養皿、移液管等。直流穩壓電源;明道式電滲析膜堆一套，外配容量為1000mL的燒杯5只，硅膠管(約0．5m)10根;小型潛水泵5個。通過發酵罐控制主機箱上的蠕動泵，將雙極膜電滲析的堿液隔室與發酵罐進行連接。為了降低發酵罐中染雜菌的風險，必須對連接的管子進行滅菌操作。發酵罐內由pH計進行實時監測，當pH低于設定值時，由蠕動泵自動將雙極膜電滲析的堿液隔室中的堿液泵入發酵罐進行調節。由于軟管內是強堿環境，故堿液室與發酵罐之間的連接管不需要進行滅菌操作。

2實驗步驟

2．1雙極膜電滲析的準備

(1)組裝膜堆:按“陽極板—隔板—雙極膜—隔板—陰膜—隔板—陽膜—隔板—雙極膜—陰極板”順序組裝膜堆，用長螺桿釘壓緊膜堆。為了確保裝置的嚴密性，應使隔板之間的墊圈厚度不超過墊圈槽，并使雙極膜的陽膜側朝向陰極板。此外，在用螺釘壓緊裝置時，應注意均勻用力，以防止裝置變形甚至斷裂。

(2)連接外圍設備:在隔板出口分別連接出水管和進水管。將進水管與外置燒杯中的潛水泵出口連接，將出水管的出口端連接到燒杯中，以確保循環通路暢通。

(3)注入料液和電極水:在鹽室中注入料液，在極室中注入電極水，在酸室和堿室中注入蒸餾水，此過程應保證料液淹沒潛水泵。對于雙極膜電滲析，應在實驗結束后將各個隔室、燒杯和潛水泵內的料液或電解質溶液清洗干凈。若長期不用，應將裝置拆卸還原，并確保各組件干燥和清潔。

2．2發酵過程的準備

(1)種子培養基的培養:配制一定量的種子培養基，并在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。滅菌條件為:121℃，20min。待培養基冷卻至室溫后，取新鮮斜面菌種，接入種子培養基中，在轉速為150r/min的搖床中培養24h，溫度恒定在37℃。

(2)發酵罐滅菌:將配制好的發酵培養基加入到發酵罐中，此處應注意體積不能超過發酵罐總體積的2/3。然后將發酵罐和培養基一起放入滅菌鍋中進行滅菌。

(3)火焰接種法:先用醫用酒精擦拭接種口;在火圈中加入酒精，點燃后套在接種口上;關小空氣進氣閥，調節進風，降低罐壓，打開接種口蓋;在火焰范圍內打開種子培養基的瓶塞，在火焰上燒灼幾秒鐘后，迅速將種子液倒入發酵罐中;在火焰上燒灼接種口蓋子數秒后，迅速蓋好接種口蓋，關閉空氣進氣閥。

(4)發酵培養:接種結束后，對發酵培養過程的各項參數進行設定，開始培養。發酵過程中要打開冷凝器水閥。具體操作參數:轉速為150r/min;溫度為37℃;pH為6．7。

2．3發酵罐與雙極膜電滲析集成操作過程的監測

在集成操作過程中，要對發酵罐和雙極膜電滲析同時進行監測，防止任一方出現問題導致集成操作失敗。發酵過程:

①通過發酵罐的主機控制發酵的pH條件、溶氧濃度和實驗溫度。每1h記錄pH、溫度和溶氧濃度，通過數據判斷發酵過程是否正常;

②每4h測量殘余葡萄糖的量、生物量和乳酸的生成量，以判斷細菌的生長情況和乳酸的生成情況。雙極膜電滲析過程:

①雙極膜電滲析過程調整穩壓電源的電壓和電流值來控制實驗條件，每1h記錄電壓、電流。

②每4h測量酸室中的乳酸濃度、堿室濃度和堿室堿液體積。

3分析方法

3．1葡萄糖和乳酸的測量

在發酵過程中，要間斷地取樣進行監測。發酵液中含有有機酸鹽、無機鹽、菌絲體、蛋白質、脂肪和糖類等。雙極膜電滲析過程的料液是經過超濾和脫色之后的發酵液，主要成分為有機酸鹽(主要為乳酸鹽)和無機鹽類物質。實驗中使用生物傳感分析儀獲得葡萄糖和乳酸含量。

3．2生物量的測量

在發酵過程中，要及時監測乳酸菌的生長情況。取樣后，用0．3mol/L的稀鹽酸溶液稀釋，目的是消除一些沉淀性鹽的影響。在波長為600nm處，測量吸光度。對于產酸量(Na)、產堿量(Nb)以及它們各自的電流效率(ηa和ηb)，可根據下面的公式計算

4實驗注意事項

(1)發酵實驗結束后，需要完成乳酸發酵液的初步提取工作。應及時向發酵罐中加入NaHCO3，使pH升高到10左右。同時升高溫度至90℃，使菌體和其他懸浮物下沉。發酵原液澄清后，將上清液收集到塑料桶中，放入冰柜中保存并用于下一步的提純。對澄清后的沉淀物集中進行處理。

(2)在利用發酵罐控制主機進行發酵液pH調節時，要控制堿液的添加速度，以使堿液與發酵液充分混合反應，并確保發酵液的pH不被調節得過高而影響微生物生長。

(3)如果裝置發生泄漏，應盡快壓緊裝置;如果情況得不到改善，應拆卸裝置、查找原因(或更換墊圈、或增加墊圈厚度等)。在實驗完畢后，應將隔室、燒杯和潛水泵內的料液或電解質溶液清洗干凈。若長期不用，應拆卸還原裝置，并確保各組件干燥和清潔。

作者：馮紅艷 徐銅文 王曉林 楊偉華 單位：中國科學技術大學化學實驗教學中心