傳統的功能微生物鑒定方法是在含有特定碳源培養基上對目標微生物進行富集、分離與純化，由于實驗室可培養的微生物只占微生物總數的0.1~1%[1]，因此以純培養技術為代表的鑒定方法存在很大局限性。20世紀后半葉，以分子生物學為特色的現代土壤微生物研究方法取得突破性進展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技術為代表的生物化學方法，以BIOLOG技術為代表的生理學方法和基于DNA多態性的微生物群落結構和功能多樣性的分子生態學技術，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、限制性片段長度多態性（RFLP）、末端限制性酶切片段長度多態性分析（T-RFLP）和實時熒光定量PCR技術（RT-PCR）等。上述技術提高了人們對土壤微生物群落結構組成的認識，但仍難提供有關微生物間相互作用及代謝功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指紋圖譜方法只能檢測環境樣品中的優勢微生物群落，但具有特定生態和環境功能的微生物通常在數量上并不占優勢[3]。因此，功能微生物很難被這些分子指紋圖譜方法所鑒別[2]。據估算，每克土壤含有約100億個微生物個體，包括100萬種不同的微生物種群。利用上述技術，從這些難以計數的土壤微生物中原位鑒別特定生態過程的微生物驅動者是難以想象的[4]。近年來得到廣泛關注的穩定性同位素探針技術與現代分子生物學相結合，可以在相對未受干擾的環境樣品中培養功能微生物，利用穩定性同位素示蹤復雜環境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鑒定生態系統重要過程的微生物驅動者。其基本原理是在土壤中添加含有穩定性同位素標記的代謝底物，土壤中利用該標記底物的微生物細胞在其生長繁殖過程中同化合成含標記元素的生物標志物。通過對生物標志物進行提取、分離、鑒定和比對分析，鑒別土壤中驅動特定生態過程的功能微生物。該方法可以準確獲得功能微生物的目的基因，避免了從浩瀚基因庫里一個個篩選目的基因的煩勞工作，已成為原位鑒定功能微生物的重要手段。

1土壤功能微生物SIP鑒定技術流程

SIP技術是耦合微生物遺傳多樣性與代謝多樣性最有力的工具之一，該技術以復雜的原位或微宇宙土壤樣品為研究對象，采用穩定性同位素原位標記土壤樣品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前絕大多數研究采用13C標記底物培養土壤，利用13C-底物的微生物細胞不斷分裂、生長、繁殖，合成含13C標記的DNA或RNA等生物標志物。提取土壤樣品中13C-核酸和12C-核酸總混合物，用超高速離心技術將13C-核酸與12C-核酸分離，利用分子生物學手段對生物標志物進行分析，以鑒別土壤功能微生物。近年來，以15N和18O為基礎的SIP技術也被成功應用于微生物驅動的土壤生態過程研究[6]。

1.1土壤SIP技術前處理方法選擇

SIP技術前處理包括標記底物的培養和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取兩個步驟。培養方式主要包括添加營養液富集培養和僅添加標記底物培養等方式。添加營養液富集培養法可以為微生物生長提供相對穩定的環境，并促進微生物的生長，以獲得足夠的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括試劑盒提取法和液氮研磨法等。試劑盒法操作簡單，提取純度高，但提取量較低，費用高。液氮研磨法可以較好保證DNA/RNA的完整性，提取量相對較高，且操作費用低，時間短，但需純化后才能滿足RT-PCR等后續分子生物學要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要為兩種：一種是PLFAs法，即先通過氯仿-甲醇單相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再經硅膠柱純化以及酯化作用得到活體細胞膜結合態FAME，提取的脂肪酸種類僅有El-脂肪酸，多為細菌所特有。另一種是TSFAMEs法，即通過堿甲醇分解法提取總土壤FAMEs。提取的脂肪酸種類包括酯連接和非酯連接PLFAs，多為真菌所特有[9]。

1.2土壤SIP技術中生物標志物的選擇

土壤SIP技術中特定微生物的生物標志物為PLFA、DNA和RNA3種。PLFA-SIP法是將PLFA從重穩定性同位素（如13C）標記過的環境樣品中提取出來，通過PLFA圖譜分析微生物群落的結構和多樣性，再通過氣相色譜-燃燒-同位素比率質譜聯用法測定各種PLFA中13C的豐度[7]。PLFA-SIP的標記底物濃度要求較低，靈敏度較高，但存在一些缺點：（1）對于未知PLFA分子圖式的不可培養微生物，或者土壤中的某種特殊脂肪酸無法與特定種類的微生物相對應，該方法就無法鑒定功能微生物。（2）該方法在很大程度上依賴于標記脂肪酸來確定土壤微生物群落結構，標記上的變動將導致群落估算上的偏差。（3）細菌和真菌生長條件的改變或環境脅迫都能導致脂肪酸類型的改變[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可獲得更直接的功能微生物遺傳信息。DNA-SIP的優點是：標記的13C-DNA一定來自新產生的子代微生物細胞，是證明微生物原位生長并驅動生態過程的最直接證據。另外，DNA完美的雙鏈結構保證了遺傳物質的穩定[10]。DNA-SIP的缺點是：自然環境中能被微生物利用的底物濃度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用較高濃度的標記底物來刺激目標微生物的分裂繁殖，可能導致研究結果與原位自然環境的實際情況不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺點。自然環境中特定功能微生物發揮作用的同時，即使沒有大量增殖生長，但具功能基因得到表達并在核糖體內合成蛋白質，獲得標記的13C-RNA則表明微生物可能具有較強的活性。因此，RNA-SIP能夠采用更低的標記底物濃度培養環境樣品，研究結果更接近原位狀況[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的實際應用仍存在較大的技術難度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的結合將會大大提升SIP技術的潛力。

1.3土壤SIP分離后的分析方法

13C-核酸與12C-核酸分離后，可以利用分子生物學手段對功能微生物的DNA/RNA進行分析，以鑒別土壤中重要生態過程的微生物驅動者。目前的主要分析方法包括分子指紋圖譜法、實時定量PCR法和454高通量測序法等。（1）分子指紋圖譜法是目前進行功能微生物的DNA/RNA分析的廣泛使用的快捷方法，但分子指紋圖譜分析方法的靈敏度較低。環境樣品中微生物通常數以百萬計，采用古菌或細菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能檢測環境樣品中數量上占優勢的微生物[14]。具有較為重要的生態和環境功能目標微生物通常在數量上不占優勢。因此，目標微生物同化利用13C-底物后發生的微小變化很難被分子指紋圖譜法所鑒別。（2）實時定量PCR法直接針對目標微生物的功能基因，采用高度靈敏的實時定量PCR測定不同密度層級中目標微生物的數量，顯著提高了SIP技術的可靠性。然而，采用特異引物定量研究目標微生物存在一定難度。土壤中數量眾多的微生物基因組DNA可能被13C標記，很難采用單一的功能基因或16SrRNA基因特異引物，同時研究眾多目標微生物在不同密度層級中的分布規律。我們無從得知哪一種微生物可能利用穩定性同位素標記底物，無法設計特異的功能引物，只能通過選擇性定量目標微生物，明確目標微生物在不同密度層級中的分布規律，同時判定SIP技術的可靠性[13，15]。（3）454高通量測序法是通過檢測各浮力密度層中微生物16SrRNA基因組成，分析目標標記微生物占該層總微生物的比例，從而鑒別前所未知的重要功能微生物。該技術可規避PCR擴增，直接對標記13C-RNA測序，每次分析可獲得大約100萬16SrRNA基因序列，顯著增強了重浮力密度層中13C-標記微生物DNA序列的檢測靈敏度。高通量測序可全面分析微生物群體的物種、基因功能組成，最大程度地認識未培養微生物的遺傳組成和生命活動，是目前最準確的方法[16]。但該方法目前測試費用較高，后續數據處理復雜，但隨著技術發展必將成為功能基因組學研究的主流技術。