作者：沈海萍 樸永哲 祖國仁 夏先鋒 趙長新 單位：大連工業大學生物工程學院 大連民族學院生命科學學院

國際上，丹麥學者論證了混菌發酵中釀酒酵母CCMI885蛋白類分泌物對幾種非釀酒酵母具有拮抗作用，并且用單項電泳分離出分子量在2~10ku的蛋白毒素[10]。國內，翟明昌等[11]發現了釀酒酵母FFC2144的存在導致了克魯維酵母FCC2116的提前死亡，并排除空間爭奪、溶氧、酒精度、pH、氮源等因素，確定是釀酒酵母的分泌蛋白導致了克魯維酵母的提前死亡，并指出釀酒酵母大分子量分泌蛋白對克魯維酵母也具有拮抗作用；并采用雙向電泳方法研究了克魯維酵母非程序衰亡的胞內蛋白組表征[12]。本實驗在前人研究的基礎上，通過雙向電泳技術，從蛋白組學層面進一步研究釀酒酵母分泌的哪些蛋白導致了克魯維酵母的提前死亡，并試圖揭示釀酒酵母產生抑菌蛋白的機制。

材料與方法

1.1材料與儀器釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeFFC2144）大連工業大學菌種保藏中心；耐熱克魯維酵母（KluyveromycesThermotoleransFCC2116）大連工業大學菌種保藏中心；培養基采用改良的全合成培養基（L）[13]40g葡萄糖，6g檸檬酸，6gDL-蘋果酸，1.5g酒石酸，6.7gYNB（Yeastnitrogenbasewithoutaminoacids，Difco），10g（NH4）2SO4，0.5g色氨酸，0.5g組氨酸，0.5g精氨酸，pH3.3。圓盤式電泳儀及垂直板電泳槽北京六一廠；1L螺口瓶紗布封口。

1.2菌體培養培養條件：28℃，搖床轉速100r/min。透析培養：將克魯維酵母接種于透析袋（截留分子量為10ku）的內部，接種后袋內共計15mL發酵液，釀酒酵母接種于透析袋的外部，接種后袋外共計485mL發酵液，接種濃度均為1×104cfu/mL。

1.3菌體生長曲線測定自接種時刻開始，每5h在無菌室取發酵液，稀釋涂平板（YPDA培養基[12）]，培養12~24h，單菌落計數，并合算成該時間段的菌體濃度（cfu/mL）。

1.4蛋白提取根據釀酒酵母FFC2144菌體濃度（生長進入平衡期）、殘糖[14（]少于2g/L）及酵母細胞完整性，選擇發酵60h為釀酒酵母FFC2144胞外蛋白提取時間。胞外蛋白提取方法-超濾法：發酵液于6000r/min離心，得上清液。上清液用10ku的超濾膜冰浴濃縮，雙蒸水多次沖洗以去掉雜質及小分子物質，再通過反沖洗濾膜，將截留的大分子物質沖洗下來。將蛋白濃縮液冷凍干燥，待用。

1.5抑菌實驗離心后的發酵上清液用超濾方法除去糖、酸、醇、酯等較小分子量物質，并且通過冷凍干燥法將其體積從的150mL左右體積的溶液濃縮到約10mL，將得到的胞外蛋白濃縮液加入到剛剛接種的克魯維酵母FCC2116的純菌發酵液中，進行培養。動態觀測克魯維酵母的生長情況（即各時段菌體濃度）。

1.6雙向電泳樣品制備：在冰浴條件下，將凍干的蛋白溶解于適量的蛋白溶解液（8mol/L尿素，50mmol/LDTT，5%Triton×100，2.5%pH4~6兩性電解質，0.5%pH3~10兩性電解質）中，并輔助超聲及漩渦振蕩促進溶解。目測蛋白溶解后，于13000r/min離心10min，取上清液，用考馬斯亮藍法測定溶解液中蛋白濃度，添加新鮮溶解液，混勻，使各樣品蛋白終濃度為150μg/15μL（上樣量），并按上樣量分裝，冷凍保藏。上樣前樣品中加入微量溴酚藍指示劑，充分混勻。膠條制作：在王祥余等[15]方法基礎上略加修改，注膠量不以體積計，而保證每根膠長度為7cm。等電聚焦條件：200V0.5h，500V1h，1350V4h；每次升高電壓時，按約200V/min速度勻速緩慢提升電壓。平衡條件：兩步平衡。平衡液1∶6mol/L尿素，2%SDS，100mmol/LTris（pH8.8），30%甘油，1%DTT，15min；平衡液2∶6mol/L尿素，2%SDS，100mmol/LTris（pH8.8），30%甘油，2%碘乙酰胺，15min。SDS-PAGE：5%的濃縮膠，12%分離膠。染色方法：Neuhoff考染法[16]。

1.7凝膠圖像分析凝膠通過BINTA2020D型凝膠成像系統進行拍照，利用PDQuest8.0軟件完成對凝膠圖像的剪裁、斑點檢測、匹配、差異比較。

結果與討論

2.1釀酒酵母胞外蛋白對克魯維酵母的影響對圖1中三組關鍵差異數據進行整理分析，得表1（各組數據重復性標準偏差以±標注）。通過Excel數據分析，空白組和純培養胞外蛋白添加組的p為0.2316，而空白組比對透析蛋白添加的p為0.000813＜0.05，因此可以判斷：釀酒酵母FFC2144純培養的大分子量蛋白（大于10ku）的添加對克魯維酵母FCC2116生長影響不大，而透析培養得到的胞外蛋白對FCC2116有顯著影響。由此可以推斷，釀酒酵母FFC2144分泌出對魯維酵母生長具有拮抗作用的蛋白類物質這一現象并非自發；即在透析培養中，克魯維酵母FCC2116產生一種小分子信號物質，誘導釀酒酵母FFC2144分泌出特異蛋白。其中部分新增的特異蛋白（包含于2DE圖譜的總新增蛋白點中），最終導致了克魯維酵母的提前死亡。

2.2純培養和透析培養的釀酒酵母胞外蛋白圖譜比較通過PDQuest軟件，可對兩張雙向電泳圖譜進行蛋白點總數計算、同一蛋白點匹配以及差異蛋白分析（本實驗中僅對新增蛋白點進行定性分析，不進行蛋白含量的差異比較）。圖2a中，釀酒酵母FFC2144純培養胞外蛋白雙向電泳圖譜中共有79個點，主要分布在分子量大于40ku的酸性區域。圖2b中，從透析培養中提取的釀酒酵母FFC2144胞外蛋白雙向電泳圖譜中包含109個點，分布集中在分子量大于20ku的酸性和中性區域。比較圖2中a、b兩圖譜，發現透析培養蛋白圖譜上新增30個點，占純培養總蛋白種類的54%。變化如此巨大，反映了酵母蛋白分泌對環境的靈敏度，也體現了胞外蛋白分泌機制對酵母環境適應性的重大意義。增加點多分布于pH6~8區間，分子量在30ku以上。由2.1結果可推斷，這新增30個蛋白點中必包括對FCC2116的拮抗蛋白。

結論

釀酒酵母可以分泌導致非釀酒酵母提前死亡的分子量大于10ku的蛋白類毒素（有別于國際上發現的酵母小分子量抑菌蛋白），并且這種毒素的分泌不是自發的，而是在非釀酒酵母分子量小于10ku分泌物的誘導作用下才會產生。釀酒酵母透析培養胞外蛋白圖譜比純培養圖譜新增30個蛋白點，其中包括對非釀酒酵母的毒蛋白。研究結果有望為釀酒酵母拮抗蛋白的相關詮釋作補充。