本文作者：尹小樂，陳志誼，劉永鋒，于俊杰，李燕，俞咪娜 單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

材料與方法

粗毒素的提取。刮取1g新鮮稻曲球外層的厚垣孢子粉末，分別用水﹑甲醇和丙酮各80mL振蕩60min提取。超聲30min，雙層濾紙過濾，將濾液真空旋轉(zhuǎn)濃縮獲得的漿狀物即為粗毒素。每種提取方法各重復(fù)3次。

粗毒素的生物活性測定。9cm滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)襯雙層滅菌濾紙，用7mL毒素液（按1.1中所得粗毒素漿狀物用水稀釋定容至25mL）浸濕濾紙，對照加清水；小麥種子（揚麥158）用次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒90s，無菌水沖洗后置于培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿20粒，28℃培養(yǎng)4d，酌情保濕，每皿調(diào)查15粒麥粒根長，每個處理重復(fù)3次。整個試驗重復(fù)2次。胚根伸長抑制率=[（對照胚根平均長度-處理胚根平均長度）/對照胚根平均長度]×100%。

粗毒素的組分分析。HPLC檢測粗毒素用水稀釋經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后通過高效液相色譜儀Agilent1200進(jìn)行分析。檢測器為可變紫外波長檢測器（VWD）；色譜柱為EclipseXDB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動相為水-甲醇-甲酸（400﹕70﹕1，V/V）；流動相流速為0.8mL•min-1；柱溫為40℃；樣品進(jìn)樣量為20μL；紫外檢測波長為254nm。1.3.2質(zhì)譜分析將粗毒素用水稀釋經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后通過ESI源的Agilent6410三重四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件：ESI源（+）；氣體溫度350℃；氣體流速10L•min-1，霧化器壓力45psi；毛細(xì)管電壓（capillaryvoltage）4000V；碎裂電壓：135.0V；175.0V；200.0V；掃描范圍m/z100—800。

稻曲毒素A檢測方法。對全國5個稻區(qū)的224份稻曲球樣品進(jìn)行毒素A含量檢測。刮取每份稻曲球樣品的厚垣孢子，充分混勻后稱取其中0.1g粉末作為待測樣品，按照1.1的方法用水提取稻曲毒素A，按照1.3.1的方法進(jìn)行HPLC檢測。因為沒有稻曲毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，以1份采集自南京的稻曲球粉末作為參照樣品，連續(xù)檢測5次取平均峰面積M。每檢測5份樣品的同時就檢測參照樣品，在參照樣品峰面積穩(wěn)定（M±10%之內(nèi)認(rèn)定為穩(wěn)定）的前提下檢測數(shù)據(jù)認(rèn)定有效，所以比較每份樣品的峰面積就能夠相對比較出樣品真實含量的相對高低。

稻曲菌致病能力測定方法。田間試驗于2010年和2011年在江蘇省農(nóng)科院溧水基地試驗田中進(jìn)行。按照張君成等[15]方法對實驗室保存的52株稻曲菌進(jìn)行致病力測定。挑取已單孢純化的稻曲病菌株轉(zhuǎn)接到PSA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)15d。取菌株生長邊緣處用直徑為3.5mm的打孔器打孔，取12個菌絲塊放入裝有20mLPS培養(yǎng)液的50mL離心管中，在28℃、130r/min下振蕩培養(yǎng)，7d后將含有孢子和菌絲的混合液接種。用注射器注射，每穗1mL，每個菌株接種10穗，接種后做上標(biāo)記。在收割前15d調(diào)查接種結(jié)果，每株稻曲菌調(diào)查8穗的稻曲球數(shù)及病穗數(shù)，進(jìn)行病害發(fā)生程度的分級。分級標(biāo)準(zhǔn)參考唐春生等[16]方法。病指計算方法：病情指數(shù)=Σ（各級病穗數(shù)×相應(yīng)的級數(shù)）（/調(diào)查總穗數(shù)×最大病級數(shù)）×100。1.6稻曲菌產(chǎn)毒素A量與致病力相關(guān)性分析采集每株稻曲菌致病產(chǎn)生的所有稻曲球刮取厚垣孢子，充分混勻后稱取其中0.1g粉末作為待測樣品，按照1.4進(jìn)行檢測。用SPSS17.0分析軟件畫出菌株產(chǎn)毒素A量與其致病力的散點圖，計算其相關(guān)系數(shù)，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)大小分析相關(guān)程度：R＜0負(fù)相關(guān)；R=0無線性相關(guān)；|R|＞0.95顯著性相關(guān)；|R|＞0.8高度相關(guān)；0.5≤|R|＜0.8中度相關(guān)；0.3≤|R|＜0.5低度相關(guān)；|R|＜0.3關(guān)系極弱，認(rèn)為不相關(guān)。顯著性概率P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

不同提取方法所得稻曲菌粗毒素的生物活性。分別用純水、甲醇和丙酮3種極性不同的溶劑提取，獲得的粗毒素對小麥胚根生長的抑制程度不一。其中，純水和甲醇提取所得粗毒素對小麥胚根伸長的抑制活性較強，抑制率分別達(dá)59.6%和52.9%，二者無顯著差異；丙酮提取所得粗毒素處理與CK無顯著差異。

稻曲菌粗毒素及其主要活性組分分析。將3種提取方法所得粗毒素用純水稀釋，過0.45m微孔濾膜后進(jìn)行HPLC檢測，并對每個色譜峰用VWD進(jìn)行了紫外掃描。比較水-甲醇-甲酸、水-甲醇-乙酸和水-甲醇-磷酸作為流動相，發(fā)現(xiàn)磷酸的色譜峰型最好，甲酸次之，乙酸最差。考慮到后續(xù)的樣品純化工作需要盡量保持分析型HPLC和制備型HPLC工作條件的一致，本研究采用水-甲醇-甲酸流動相系統(tǒng)。同時比較了不同體積比的水-甲醇的分離效果，測定結(jié)果表明，當(dāng)流動相中水-甲醇體積比為400﹕70時，各種組分分離效果和重現(xiàn)性最好（圖1）。甲醇和水提取獲得的粗毒素色譜圖中疑似稻曲毒素A的11.394min組分（圖略）和11.385min組分（圖1，組分ii）峰面積相當(dāng)，但水提取的峰形較好且前期雜質(zhì)較少。丙酮幾乎沒有提取出疑似組分。色譜圖結(jié)果與生物毒性試驗結(jié)果一致。分別對甲醇和水提取獲得的疑似組分進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)掃描結(jié)果幾乎完全一致：均有3個吸收峰，分別在207、254、290nm（水提取紫外掃描圖見圖2，甲醇提取圖略），與已報道文獻(xiàn)中稻曲毒素A的紫外特征吸收相吻合[5,9]。因為稻曲球厚垣孢子中含有大量脂溶性的色素雜質(zhì)，但用純水提取又會出現(xiàn)厚垣孢子粉末漂浮在提取液面之上不能充分浸入液體的問題，所以在后續(xù)的研究中采用純水中加少量甲醇的方法提取稻曲毒素A。將粗毒素用純水稀釋后過0.22m微孔濾膜后進(jìn)行LC-MS分析，總離子流圖見圖3，質(zhì)譜圖見圖4。6.073min組分（Ⅰ）的ESIm/e為645.9（M+H）+、11.444min組分（Ⅱ）的ESIm/e為673.9（M+H）+、14.058min組分（Ⅲ）的ESIm/e為558.9（M+H）+、15.362min組分（Ⅳ）的ESIm/e為494.9（M+H）+，分別與國外已發(fā)表文獻(xiàn)中的稻曲毒素B（M+H，646）、A（M+H，674）、C（M+H，559）、D（M+H，495）的相對分子質(zhì)量基本一致[5]。由于質(zhì)譜圖（圖3）中峰II的保留時間與高效液相色譜圖（圖1）中峰ii的保留時間極為接近，再結(jié)合紫外吸收光譜（圖2），初步證明高效液相色譜圖中的組分ii為稻曲毒素A。

不同地區(qū)稻曲球毒素A相對含量的比較及不同。地區(qū)稻曲菌產(chǎn)稻曲毒素A量與致病力相關(guān)性分析從全國5個稻區(qū)采集224份稻曲球樣品，用HPLC檢測樣品中的毒素A的相對含量。檢測結(jié)果（表1）表明，不同地區(qū)稻曲球的平均含量差異較大；其中四川地區(qū)的平均稻曲毒素A含量最高（995），是平均含量最低的江西（535）的1.86倍。不同地區(qū)的高含量樣品所占比重差異也很大，在采集自四川的29份樣品中有15份高含量樣品，占51.7%；在采集自江西的21份樣品中只有2份高含量樣品，占9.52%。測定了來自全國7個省份52個稻曲菌菌株在感病品種兩優(yōu)培九上的產(chǎn)生致病反應(yīng)和產(chǎn)毒素A量，結(jié)果表明（表2），52個稻曲菌菌株的致病性分化十分顯著（病情指數(shù)7.5—100），產(chǎn)毒素A量也差異顯著（最高產(chǎn)量是最低產(chǎn)量的2.7倍）。運用SPSS17.0分析軟件，做出52個菌株產(chǎn)稻曲毒素A量和致病力（病情指數(shù)）的二維散點圖（圖5），其相關(guān)系數(shù)R=0.222，顯著性概率P=0.114，無統(tǒng)計學(xué)意義。分析結(jié)果表明，稻曲菌菌株的產(chǎn)毒素A量與致病力相關(guān)性不顯著。

討論

植物病原毒素是植物病原菌產(chǎn)生的對寄主植物有毒性的代謝產(chǎn)物，在病原菌侵染致病定殖過程中常起到重要作用，是導(dǎo)致植物病害發(fā)生的主要因素之一。康振生等[17]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)禾谷鐮刀菌菌絲尚在寄主體表擴(kuò)展而未侵入寄主細(xì)胞時，病菌已產(chǎn)生分泌脫氧鐮刀菌烯醇毒素DON，隨著寄主組織中DON濃度的升高，寄主細(xì)胞相應(yīng)發(fā)生了一系列病理變化，寄主細(xì)胞壞死后病菌進(jìn)入壞死的寄主細(xì)胞定殖。在病原菌毒素應(yīng)用方面，目前已有多種病原菌毒素被應(yīng)用于抗病品種篩選或抗病突變體篩選抗性評價[18-19]，而稻曲毒素在稻曲菌致病過程中所起作用尚未清楚，同時常規(guī)方法在稻曲病抗性評價上存在一定的局限性，已成為制約高抗病品種選育的主要因素之一。對稻曲毒素進(jìn)行深入分析可為深入闡明稻曲菌的致病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為稻曲病抗病育種提供新的途徑。

本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)稻曲菌培養(yǎng)液中存在抑制小麥胚根生長的活性成分，但無論是用有機(jī)溶劑還是用水浸提都無法在高效液相上檢測出稻曲毒素A，筆者轉(zhuǎn)而從稻曲球中尋找毒素A，在提取溶劑的選擇上發(fā)現(xiàn)水和甲醇都可以獲得毒素A。本研究采用水中加少量甲醇的方法提取粗毒素，并用LC-MS對粗毒素中多種活性成分進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)共有4種組分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），分別與國外已發(fā)表文獻(xiàn)中的稻曲毒素B（M+H,646、A（M+H，674）、C（M+H，559）、D（M+H，495）的相對分子質(zhì)量一致。由于質(zhì)譜圖中組分II的保留時間（11.444min）與HPLC色譜圖中組分ⅱ的保留時間（11.385min）極為接近，再結(jié)合紫外吸收光譜（圖2），初步證明高效液相檢測出了稻曲粗毒素中的毒素A。

研究病原菌不同菌株產(chǎn)毒素A量與致病性分化之間的相關(guān)性對進(jìn)一步明確病原菌的致病機(jī)理具有重要的參考價值。俞剛等[20]發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌的產(chǎn)毒能力與其致病力成正相關(guān)，不產(chǎn)毒的突變菌株對小麥等寄主的致病力顯著低于野生型菌株，雖能定殖寄主，但所需時間較長，且不能造成典型病斑，更不能在寄主組織中擴(kuò)展。桑茜等[21]發(fā)現(xiàn)不同黃萎病菌分離物分泌的粗蛋白含量存在明顯差異，與其所致的病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)，且黃萎病菌強致病力分離物分泌的粗毒素對棉苗的致萎力較強，弱致病力分離物分泌的粗毒素對棉苗的致萎力較弱。本研究用人工接種的方法，測定了52個稻曲菌株對感病品種兩優(yōu)培九的致病力，并采集每株稻曲菌致病產(chǎn)生的所有稻曲球，用HPLC檢測等重量稻曲球粉末中稻曲毒素A含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2）52株稻曲菌在兩優(yōu)培九上致病力分化和產(chǎn)毒素A量均差異顯著，但是不同稻曲菌株的產(chǎn)毒素A量與致病力相關(guān)性不顯著。由于采集稻曲球時病害已獲得充分?jǐn)U展，稻曲球中的毒素A含量的高低可能受到其它多種因素的影響，與致病力相關(guān)性很低。因此，深入研究接種稻曲菌后水稻植株內(nèi)稻曲毒素A的動態(tài)消長與致病力的相關(guān)性或許更能說明到毒素A在病程中所起作用。另外，稻曲菌屬于營養(yǎng)爭奪型病菌，致病力越強的稻曲菌病粒率越高，單個稻曲球獲得的營養(yǎng)就較少[16,22]，這對稻曲毒素A含量是否產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。