本文作者：李琦、王文芳 單位：湖南利爾康生物有限公司、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

低溫

對(duì)于酶活性蛋白,溫度影響較大.過高或過低的溫度均會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性,且有時(shí)這種變化是不可逆的.經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證,將液態(tài)紡織酶放置在50℃下3個(gè)月后,會(huì)或多或少的出現(xiàn)酸變、絮凝、沉淀、脹氣、酶活降低等現(xiàn)象,所以高溫對(duì)其有不利影響.目前液體紡織酶的保存溫度一般標(biāo)注的是4℃或25℃.4℃指的是低溫狀態(tài)保存;25℃指的是常溫狀態(tài)保存.在25℃以上存放,會(huì)縮短保質(zhì)期.在4~25℃保存,保質(zhì)期也在2者保存時(shí)間之間.在盛夏和密閉的運(yùn)輸車或集裝箱中,如不采取措施,酶制劑的外觀和酶活都可能出現(xiàn)較大的變化.杭州海關(guān)曾經(jīng)做過一次試驗(yàn),證明夏天經(jīng)過曝曬的普通集裝箱內(nèi)部溫度高達(dá)60~70℃,液體紡織酶易變性.所以應(yīng)盡量低溫保存,最好在冷庫中保存,運(yùn)輸宜用冷藏車或用干冰、冰袋冷藏.

適宜的pH

環(huán)境中的pH對(duì)微生物的生命活性影響較大,會(huì)改變基質(zhì)中氫離子濃度.主要作用:引起細(xì)胞膜電荷的變化,從而影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收;影響代謝過程中酶的活性;改變生長環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性.隨著環(huán)境pH的不斷變化,微生物生長受阻,當(dāng)超過最低或最高pH時(shí),將導(dǎo)致其死亡.在最適pH時(shí),酶活性最高,如果其他條件適合,微生物的生長速率也最高.大多數(shù)細(xì)菌、藻類和原生動(dòng)物的最適pH為6.5~7.5,在pH4~10也可以生長;放線菌一般在微堿性即pH7.5~8最適合;酵母菌、霉菌則適合于pH5~6的酸性環(huán)境,生存范圍在pH1.5~10.由于酸堿度對(duì)酶的活性影響很大,所以液體紡織酶需要選擇其合適的pH,同時(shí),一定的pH范圍也有抑菌作用.目前常用的紡織酶一般為酸性或中性,所用的助劑也必須是酸性或中性.酸性紡織酶的pH一般選擇在4~5,中性紡織酶的pH一般選擇在6~7.隨著保存時(shí)間的延長,有些酶制劑會(huì)出現(xiàn)變酸的現(xiàn)象,會(huì)使酶活降低.要延長保質(zhì)期,就要減少或避免這種情況的出現(xiàn),往往通過加入緩沖溶液維持液體紡織酶pH的穩(wěn)定.緩沖溶液的選擇以酶的種類和pH范圍為基準(zhǔn),確保酶的活性不受影響,常用的緩沖溶液有醋酸緩沖體系、磷酸緩沖體系、檸檬酸緩沖體系、硼酸緩沖體系等.使用時(shí),要注意硼酸鹽會(huì)與許多化合物形成復(fù)鹽,如蔗糖;檸檬酸鹽容易與鈣結(jié)合;磷酸鹽在有些試驗(yàn)中是酶的抑制劑甚至代謝物,重金屬易以磷酸鹽的形式從溶液中沉淀出來,而且它在pH7.5以上時(shí)緩沖能力很小.

控制微生物污染

液體紡織酶如受微生物的污染,會(huì)變得不穩(wěn)定.酶制劑的微生物污染原因很多,可能在生產(chǎn)或灌裝過程中,衛(wèi)生控制不嚴(yán)格,也可能是后期防腐控制不到位,或外部條件適宜雜菌生長.控制微生物是一般企業(yè)所采取的手段,方法很多,如下所述.

1保持合適的滲透壓

在高溫環(huán)境下,國產(chǎn)的液體酶制劑可能會(huì)出現(xiàn)脹氣的情況,而國外公司如諾維信、杰能科的液體酶制劑產(chǎn)品則不會(huì)出現(xiàn).要改變此情況,可以從控制滲透壓入手.選擇合適的滲透壓可抑制微生物的生長,從而延長保質(zhì)期.適宜于微生物生長的滲透壓范圍較廣,而且它們往往對(duì)滲透壓有一定的適應(yīng)能力,如突然改變滲透壓會(huì)使微生物失去活性,所以,需要逐漸改變滲透壓,使微生物能適應(yīng)這種改變.一般微生物的細(xì)胞膜屬半透膜,細(xì)胞若置于高滲溶液中,水將通過細(xì)胞膜從低濃度的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞周圍的溶液中,造成細(xì)胞脫水而引起質(zhì)壁分離,使細(xì)胞不能生長甚至死亡.相反,若將微生物置于低滲溶液或水中,外部環(huán)境中的水將從溶液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞膨脹,甚至使細(xì)胞破裂.一般液體紡織酶是高濃縮型,用低滲透壓不行,只能考慮高滲透壓.利用一般微生物不能耐受高滲透壓來延長保質(zhì)期,如常用的高濃度糖或鹽等.雖然應(yīng)用較多,但添加的劑量較大.另一種是添加控制滲透壓的物質(zhì),在實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)其有較好的效果.

2降低含氧量

微生物的增殖需要不同的氣體環(huán)境,有需氧微生物、厭氧微生物和兼性厭氧微生物.在有氧的環(huán)境中,霉菌、酵母和細(xì)菌都能引起變質(zhì),而缺氧時(shí),引起變質(zhì)的只能是酵母和細(xì)菌.高濃度CO2和N2對(duì)有氧呼吸和無氧呼吸都有抑制作用,從而可抑制微生物生長,所以,在發(fā)酵結(jié)束后或灌裝時(shí)可通入高濃度CO2或N2,但具體的方式或工藝,還有待摸索.

3使用抗生素

一般選擇抗菌范圍廣,抗菌能力強(qiáng)的抗生素.廣譜抗生素是指能夠抵抗大部分細(xì)菌的藥物,比如脫氫醋酸鈉.還有一種窄譜抗生素,是專門殺滅某一種或一類細(xì)菌的藥物.廣譜抗生素主要是用在致病菌還未知,但需要?dú)⒕臅r(shí)候,當(dāng)明確致病菌的時(shí)候,用窄譜抗生素針對(duì)性的殺菌.目前常用的窄普抗生素是氯霉素、金霉素、土霉素、四環(huán)素等,不僅能強(qiáng)力抑制大部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌,而且能抑制立克次體、螺旋體和某些原蟲.新型抗生素納塔霉素[1],不僅可用于工業(yè)、食品,對(duì)酵母和霉菌等也有好的效果,且有廣泛的pH范圍,在pH4.0時(shí)都可耐受2~3周.

4使用化學(xué)防腐劑

中國允許在一定量范圍內(nèi)使用的防腐劑有30多種,包括苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鉀鹽、二氧化硫、焦亞硫酸鈉(鉀)、丙酸鈉(鈣)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、脫氫醋酸等,其中使用較多的是山梨酸和苯甲酸及其鹽類.山梨酸及其鹽類是良好的防腐劑,不但低毒,而且對(duì)于霉菌、酵母、好氣性細(xì)菌均有抑制作用.山梨酸的抗菌機(jī)理是其分子結(jié)構(gòu)上的α、β位上的雙鍵阻止了霉菌的脫氫,降低了微生物的新陳代謝.此外,山梨酸還能與微生物系統(tǒng)中的巰基結(jié)合,從而破壞許多酶系作用,達(dá)到抑制微生物增殖的目的.在使用不同種類的化學(xué)防腐劑時(shí),要注意是用于工業(yè)級(jí)、食品級(jí)還是飼料級(jí)的酶制劑,以及各種防腐劑適合的pH范圍、添加量.

5使用天然防腐劑

鑒于化學(xué)合成防腐劑的安全性和其他缺陷,人們正在探索更安全、使用更方便的天然防腐劑[2],如微生物源的乳酸鏈球菌素、納塔霉素、紅曲米素等;動(dòng)物源的溶菌酶、殼聚糖、魚精蛋白[3]、蜂膠等;植物源的果膠分解物、瓊脂低聚糖、中草藥、辛香料、大蒜素、茶多酚、銀杏提取物、花生殼提取物、大豆異黃酮等[4];微生物、動(dòng)物和植物復(fù)合源的R-多糖等.一般來說,天然防腐劑安全性更好,但價(jià)格昂貴,限制了其使用.

6使用復(fù)合防腐劑

每種防腐劑都有對(duì)其敏感和不敏感的微生物,所以用復(fù)合防腐劑就可以利用其協(xié)同作用,擴(kuò)大抑菌的范圍,提高抑菌的強(qiáng)度,比單一防腐劑的效果要好.張赟彬等人[5]發(fā)現(xiàn)通過與二丁基羥基甲苯(BHT)、蔗糖脂肪酸酯、山梨酸鉀復(fù)配的八角茴香精油對(duì)散裝肉抑菌效果明顯好于使用單一防腐劑,其中以山梨酸鉀復(fù)合八角茴香精油防腐劑的抑菌活性最為顯著.馮治平等人[6]對(duì)雪梨果汁作保藏試驗(yàn)研究,經(jīng)過10周的保藏,未添加防腐劑的雪梨汁樣品糖度下降了26%;添加山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉及復(fù)合防腐劑的雪梨汁樣品糖度分別下降11.6%、9.2%和8%.李冬冬等人[7]發(fā)現(xiàn)將乳酸鈉、雙乙酸鈉、葡萄糖-γ-內(nèi)酯單獨(dú)使用時(shí)均不能很好地抑制鹵蛋中微生物的生長,而選擇0.2g/kg乳酸鈉、0.02g/kg雙乙酸鈉、0.02g/kg葡萄糖-γ-內(nèi)酯作為復(fù)配型抑菌劑時(shí),能顯著地抑制鹵蛋中微生物的生長,其抑菌效果優(yōu)于單一防腐劑.彭家澤[8]通過脫氫醋酸鈉及其復(fù)配形式在面制品、肉制品、豆制品中的防腐應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)單一防腐劑處理,脫氫醋酸鈉的抑菌能力優(yōu)于山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈣;復(fù)配形式以脫氫醋酸鈉與月桂酸單甘油酯為主體,配以山梨酸鉀或丙酸鈣、雙乙酸鈉,其防腐效果較單一防腐劑好.在使用復(fù)合防腐劑時(shí),要注意選擇合適的搭配.其一,陰離子和陽離子在一起可能會(huì)產(chǎn)生沉淀.錢木水等人[9]發(fā)現(xiàn)一般陰離子型的防腐劑(如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等)遇到陽離子的物質(zhì)(如鐵鹽、生物堿鹽類)往往產(chǎn)生沉淀.同理,陽離子型的防腐劑(如季銨鹽類)遇到陰離子的物質(zhì)(如脂肪酸鹽、氨基酸等)也會(huì)產(chǎn)生沉淀.陰離子型和陽離子型的防腐劑不能同時(shí)使用,一般最好用非離子型的.另外,山梨酸與堿、氧化劑、還原劑和重金屬有反應(yīng),遇到非離子型表面活性劑時(shí),活性會(huì)降低.其二,注意相互搭配時(shí)的溶解度和穩(wěn)定性.防腐劑的種類很多,其溶解度是不同的,有些易溶于液體,有些需要加熱溶解,有些難溶解.在復(fù)配時(shí),特別要注意有時(shí)一種物質(zhì)會(huì)影響另一種物質(zhì)的溶解性或穩(wěn)定性.還要注意加料的順序,如果配制工藝稍有不慎,可能會(huì)使防腐劑的溶解度偏低或產(chǎn)生沉淀或絮凝,導(dǎo)致在酶制劑中的有效物質(zhì)達(dá)不到其最低的防腐濃度.

7使用表面活性劑

表面活性劑的殺菌作用歸結(jié)于它們與細(xì)菌生物膜蛋白質(zhì)的強(qiáng)烈作用使之變性或失去功能,從而影響微生物細(xì)胞的生長與分裂.在選擇表面活性劑時(shí)要注意產(chǎn)品中應(yīng)不含有APEO,這既是自身安全意識(shí)的增強(qiáng),也是出口安全的要求,一般常用非離子型表面活性劑.王超等[10]發(fā)現(xiàn),非離子表面活性劑能對(duì)酸性纖維素酶起到促進(jìn)作用,原因是非離子表面活性劑與酶的結(jié)合弱,不會(huì)對(duì)酶的構(gòu)象產(chǎn)生很大的影響,酶能夠容易的吸附并移動(dòng)到其他的結(jié)合部位,繼而具有良好的活性.文飛等[11]發(fā)現(xiàn),陰離子或陽離子表面活性劑易與纖維素酶結(jié)合,對(duì)酶制劑的性能影響顯著,不利于酶制劑的穩(wěn)定性和活性,在復(fù)配中應(yīng)當(dāng)盡量避免使用.

8保持無菌環(huán)境

從生產(chǎn)到完成包裝整個(gè)過程處于無菌狀態(tài),這對(duì)設(shè)備、廠房、人員等要求較高,投入較大,但是無菌環(huán)境可減少酶制劑的雜菌,從而延長保質(zhì)期.例如,諾維信的產(chǎn)品中雜菌的含量很低.

結(jié)語

延長液體紡織酶的保質(zhì)期是個(gè)很大的課題,值得長期的探索.