1應(yīng)用于微球內(nèi)外徑等尺度指標(biāo)的自動(dòng)測(cè)定

將微球投入溶液中，使其分布較均勻，并置于顯微鏡下觀察，得到清晰的微球顯微圖像。根據(jù)我們先前的工作，通過(guò)測(cè)定微球的外徑D以及其在溶液中所成像的黑環(huán)內(nèi)徑的d，可以根據(jù)有關(guān)理論方程來(lái)確定微球或其周邊介質(zhì)的折射率。因此，需要精確測(cè)定D與d。下面介紹我們用VBAI編寫(xiě)的程序如何實(shí)現(xiàn)對(duì)微球像D與d的智能自動(dòng)測(cè)定。進(jìn)入VBAI的InspectionState編輯窗口，可以編輯整個(gè)程序的主要過(guò)程。我們的設(shè)計(jì)是:先在“Inspect”過(guò)程中對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理并找到物體，得到物體個(gè)數(shù);然后在“GOON?”過(guò)程中判斷檢測(cè)到幾個(gè)物體，是否已經(jīng)檢測(cè)完全部物體;隨后在“Measure”過(guò)程中對(duì)當(dāng)前序號(hào)的物體進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)入每個(gè)過(guò)程進(jìn)行具體步驟的編輯，只需雙擊右側(cè)工具中的相應(yīng)操作，就可以將該操作加入程序中，在屬性窗口中對(duì)操作的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定。在“Inspection”過(guò)程中，我們首先打開(kāi)圖片，選中循環(huán)取圖將依次獲取目標(biāo)文件夾中的每個(gè)圖像文件。如要測(cè)量真實(shí)尺寸，則要對(duì)圖像進(jìn)行標(biāo)定，VBAI中Calibrateimage有多種方式。通常實(shí)驗(yàn)室顯微鏡采用顯微標(biāo)尺進(jìn)行標(biāo)定，選擇第一種模式，導(dǎo)入顯微標(biāo)尺的圖像，標(biāo)定完成后生成標(biāo)定文件，檢測(cè)時(shí)自動(dòng)讀取。

接著我們對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，這將打開(kāi)visionassistant窗口，可對(duì)圖像進(jìn)行LUT變換、濾波、分割、形態(tài)學(xué)變換等多項(xiàng)操作，在本實(shí)例中將圖像處理為適合尋找物體的二值化圖像。然后對(duì)處理過(guò)的二值化圖片進(jìn)行DetectObjects操作，得到物體數(shù)列。SelectImage操作將原圖像讀入，代替處理過(guò)的二值化圖像，為下一步檢測(cè)做準(zhǔn)備。SetVariable的操作是將DetectObjects操作中檢測(cè)到的物體個(gè)數(shù)存入代表剩余物體數(shù)的X。“GOON?”過(guò)程中沒(méi)有圖像處理的具體操作，只在InspectionState編輯中有一個(gè)判斷，在指向end的箭頭定出編輯走向end的條件，為剩余物體數(shù)X＜1，當(dāng)X≥1時(shí)將執(zhí)行默認(rèn)箭頭，走向“Measure”過(guò)程。“Measure”過(guò)程中，首先IndexMeasurements讀取之前DetectObjects中檢測(cè)得到的物體數(shù)列的的第X個(gè)物體。接著，要設(shè)置程序可以根據(jù)物體的位置、大小等自動(dòng)建立相應(yīng)的ＲOI，即檢測(cè)區(qū)域，由于要進(jìn)行微球圖像直徑的檢測(cè)，因此區(qū)域類型選擇圓環(huán)形。然后就可以在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行圓的直徑檢測(cè)了，利用FindCircularEdge操作可以很方便地做到這一點(diǎn)。在直徑檢測(cè)中，程序在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)沿徑向生成一系列的檢測(cè)線，曲線為沿檢測(cè)線方向上灰度值變化曲線的一次導(dǎo)數(shù)曲線，反映了灰度值的變化速率，負(fù)數(shù)部分對(duì)應(yīng)圖像由亮變暗，正數(shù)部分對(duì)應(yīng)圖像由暗變亮，極值處即變化速率最快處，也就是邊緣所在位置。曲線上方的參數(shù)設(shè)定包括判斷邊緣的閾值，平滑算子的大小，取樣寬度，每條檢測(cè)線之間的間隔等。由于是根據(jù)擬合出的曲線確定邊緣位置，因此可以超越像素的限制，實(shí)現(xiàn)亞像素等級(jí)的超分辨率精確度。

檢測(cè)程序首先得到每條檢測(cè)線上的邊緣點(diǎn)位置，再根據(jù)所有邊緣點(diǎn)擬合出圓形邊界，計(jì)算出直徑數(shù)值，程序中給出精確到0．01個(gè)像素的結(jié)果。結(jié)果的穩(wěn)定性還要取決于拍攝環(huán)境、光照、相機(jī)穩(wěn)定性等。圖像中微球邊緣的黑環(huán)是由于光線折射造成的，根據(jù)我們先前工作，證明其粗細(xì)與微球與溶液的折射率比值成一定比例關(guān)系。因此，程序中通過(guò)分別測(cè)量各微球的D與d，調(diào)整FindCircularEdge操作中搜尋方向、邊緣種類等參數(shù)可以搜尋到內(nèi)徑圓和外徑圓。在精確測(cè)定D與d值后，可自動(dòng)根據(jù)我們先前工作導(dǎo)出的方程式，給出微球的折射率或是其周邊介質(zhì)的折射率。Calculator是界面類似LabVIEW圖像化編程工具的一項(xiàng)功能，可以由用戶自己選擇輸入輸出量、制定復(fù)雜的運(yùn)算程序等，本實(shí)例中為利用文獻(xiàn)的方程式計(jì)算出微球的折射率。DataLogging可以選擇需要記錄的數(shù)據(jù)寫(xiě)入指定的txt或csv文件，以便后續(xù)的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。最后SetVariable將變量X減1。VBAI應(yīng)用編寫(xiě)完成后可作為專用的檢測(cè)軟件使用，處理圖片時(shí)將需要分析的圖像放在同一目錄下，進(jìn)入VBAI文件，指定該路徑，點(diǎn)擊ＲunInspectioninLoop，就可以自動(dòng)完成所以圖片的分析，并得到記錄有數(shù)據(jù)的txt或csv文件。這樣生成的檢測(cè)程序智能、客觀、準(zhǔn)確、快速，實(shí)現(xiàn)了圖像中微球的識(shí)別尋位、移動(dòng)ＲOI建立、兩個(gè)直徑的測(cè)量、折射率計(jì)算、數(shù)據(jù)保存等操作的完全自動(dòng)化運(yùn)行。而且整個(gè)操作與運(yùn)算排除了人為操作中的主觀性因素，精度亦達(dá)到亞像素水平，平均單個(gè)微球的測(cè)量時(shí)間僅需0．20s。為了檢驗(yàn)其測(cè)定的準(zhǔn)確性，在對(duì)拍攝系統(tǒng)和環(huán)境進(jìn)行標(biāo)定和控制之后，選擇合適的微球作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行多次檢測(cè)。同時(shí)，用以往常用的油浸法對(duì)微球折射率作對(duì)照測(cè)定，測(cè)得的折射率與本VBAI生成系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果高度吻合，說(shuō)明VBAI檢測(cè)程序的測(cè)量準(zhǔn)確性可重復(fù)性較高。

2應(yīng)用于細(xì)胞檢測(cè)

2．1背景

細(xì)胞是生物醫(yī)學(xué)研究的重要對(duì)象之一，通過(guò)分析細(xì)胞的顯微圖像我們可以得到很多有用的信息。紅細(xì)胞是人類血液中存在的主要細(xì)胞，一直是研究的熱點(diǎn)。正常的紅細(xì)胞呈雙凹圓盤(pán)狀，而衰老和不健康的紅細(xì)胞會(huì)呈棘形、雙凹消失等不規(guī)則的形態(tài)。通過(guò)觀察與分析顯微圖像中紅細(xì)胞的形態(tài)可以評(píng)價(jià)其健康程度。所以這里以紅細(xì)胞為例說(shuō)明如何采用VBAI編寫(xiě)適合于進(jìn)行細(xì)胞圖像分析的技術(shù)過(guò)程。

2．2方法

將紅細(xì)胞懸浮于緩沖液中，置于顯微鏡下觀察，利用數(shù)碼CCD攝像頭拍攝下細(xì)胞的圖像。檢測(cè)程序上需要先尋找到各個(gè)細(xì)胞，再對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，與微球檢測(cè)的過(guò)程類似，程序總體設(shè)計(jì)上依然可以利用上節(jié)中微球的檢測(cè)程序的設(shè)計(jì)，但需要根據(jù)有關(guān)圖像處理分析的內(nèi)容更改具體的圖像處理分析操作。在圖像預(yù)處理操作中需要將原始圖像處理為適合物體識(shí)別的二值化圖像，利用VisionAssistant，先對(duì)圖像轉(zhuǎn)灰度圖像、適當(dāng)?shù)腖UT處理，在分割處理上，由于細(xì)胞邊緣處明暗對(duì)比較大，邊緣銳利，因此選用基于移動(dòng)窗口分割的算法可以較容易地找到邊緣。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較證明，選用Backgroundcorrection分割，可綜合局部和全局的灰度變化信息。分割移動(dòng)窗口大小設(shè)置為邊長(zhǎng)接近細(xì)胞邊緣寬度2倍的正方形最為合適。分割完成后再對(duì)二值圖像進(jìn)行一定的形態(tài)學(xué)變換操作，將邊緣盡量變得閉合并填充孔洞。最后進(jìn)行DetectObjects操。接著將對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析。首先根據(jù)DetectObjects操作中所檢測(cè)到的物體列表，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)區(qū)域的建立，即設(shè)置ＲOI。然后依然使用FindCircularEdge操作，在該操作中調(diào)整參數(shù)，使得檢測(cè)線能較準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)邊緣。該操作完成后，將輸出一項(xiàng)名為Deviation的參數(shù)，該參數(shù)代表了細(xì)胞邊緣與標(biāo)準(zhǔn)圓的標(biāo)準(zhǔn)偏差。同時(shí)該操作還可以得到細(xì)胞直徑等相關(guān)的信息。將Deviation除以直徑后可以得到細(xì)胞邊緣與標(biāo)準(zhǔn)圓的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，由于健康紅細(xì)胞的圖像是近似圓形的，因此Deviation參數(shù)可以一定程度上反映紅細(xì)胞的健康程度。將實(shí)驗(yàn)中拍攝到的采用不同保存格式、保存不同天數(shù)的紅細(xì)胞圖片歸類，用VBAI程序進(jìn)行分析，結(jié)果保存在csv文件中。為較健康的細(xì)胞，圖像中細(xì)胞外輪廓近似圓形，Deviation/Ｒ=1．2‰;為發(fā)生了一定形變的細(xì)胞，Deviation/Ｒ=3．2‰為嚴(yán)重變形的棘形細(xì)胞，Deviation/Ｒ=7．3‰。隨著細(xì)胞變形程度加重，細(xì)胞的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值也隨之增加。通過(guò)軟件分析的優(yōu)勢(shì)在于:可以客觀而定量地給出每個(gè)細(xì)胞的變形程度;可以快速自動(dòng)地分析大量的圖片，得到大量的數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)處理，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除此之外，還可以獲得細(xì)胞的大小信息，通過(guò)視野內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)，得到細(xì)胞分布密度信息等。

3應(yīng)用于圖像的改善

3．1背景

某些生物醫(yī)學(xué)樣品的顯微圖像，由于各種原因，其清晰度與對(duì)比度都不能滿意，對(duì)此，也可以運(yùn)用VBAI的圖像處理的方式對(duì)圖像進(jìn)行改善。下面介紹花粉孢子斷層掃描圖像中噪音及對(duì)比度不理想的斷層圖作改善的技術(shù)過(guò)程。

3．2方法

首先對(duì)整幅圖像中的噪雜進(jìn)行去除，通常改善的方法有空域?yàn)V波和頻域?yàn)V波，兩種方法都可通過(guò)VisionAssistant中的算法實(shí)現(xiàn)。其中空域?yàn)V波的算子較多，功能更加豐富。不僅提供了低通、高通等10多種算子、每種算子3×3，5×5，7×7三種尺寸，還可以由用戶自定義算子以滿足特殊需要。整幅圖像改善完成后對(duì)左右對(duì)比度及清晰度不理想的花粉孢子斷層圖像進(jìn)行增強(qiáng)，首先建立一覆蓋中央花粉孢子像的區(qū)域，使用一可旋轉(zhuǎn)的長(zhǎng)方形區(qū)域，長(zhǎng)方形的方向與左右像平移的方向垂直，寬度等于左右像平移的距離。接著利用Calculator操作計(jì)算圖11(a)左右像的位置。輸入中央像的中心點(diǎn)(X0，Y0)、角度α和平移距離L，則左像、右像中心點(diǎn)(X1，Y1)，(X2，Y2)分別為:X1=X0+L•cosαY1=Y0－L•sinαX2=X0－L•cosαY2=Y0+L•sinα以此為中心點(diǎn)坐標(biāo)參數(shù)，長(zhǎng)寬與角度參數(shù)使用中央?yún)^(qū)域的長(zhǎng)寬與角度，分別建立覆蓋左右像的區(qū)域，使用VisionAssistant對(duì)左右區(qū)域內(nèi)的圖像進(jìn)行對(duì)比度、明暗度的調(diào)整增強(qiáng)。得到處理后的圖像，三個(gè)層面的圖像的對(duì)比度基本相同。利用VBAI對(duì)圖像進(jìn)行處理與改善，不僅功能豐富，適用性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)單，易于掌握，程序建立完成后還可以快速的對(duì)其他同類圖片進(jìn)行處理，大大節(jié)省了時(shí)間。

4結(jié)語(yǔ)

使用VBAI創(chuàng)建圖像分析處理程序，可對(duì)各種生物醫(yī)學(xué)對(duì)象進(jìn)行分析和檢測(cè)，可對(duì)圖像進(jìn)行處理與改善，其優(yōu)勢(shì)在于:

(1)相比起人眼觀測(cè)和手動(dòng)測(cè)量，本方法能夠提供客觀和量化的數(shù)據(jù)，可快速對(duì)大量圖像進(jìn)行自動(dòng)分析并保存檢測(cè)結(jié)果。

(2)相比起通用化的測(cè)量分析軟件，本方法針對(duì)性強(qiáng)，針對(duì)各種特定情況和需要制定適應(yīng)的程序，準(zhǔn)確性、有效性和實(shí)用性高。

(3)相比起使用VC等編程軟件編寫(xiě)特定測(cè)量分析軟件，本方法簡(jiǎn)單，有大量強(qiáng)大的模塊化功能自由選用，程序開(kāi)發(fā)周期短，工作量小，不需要專業(yè)編程技能，一般人易于掌握，且程序易于調(diào)整改進(jìn)。綜上所述，使用VBAI可簡(jiǎn)單快捷的針對(duì)不同生物醫(yī)學(xué)圖像建立相應(yīng)檢測(cè)處理程序，可快速自動(dòng)地對(duì)大量圖像進(jìn)行分析，得到客觀量化的數(shù)據(jù)。VBAI是實(shí)驗(yàn)室快速建立生物醫(yī)學(xué)圖像處理與分析檢測(cè)程序的有力工具。

作者：查悅明 陀韋為 王卓 張剛平 黃耀熊 單位：暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系