維氏氣單胞菌隸屬弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭陰性桿菌，兼性厭氧型。氣單胞菌廣泛存在于各種水體生態系統中，比如淡水、沿海水域以及污水中［1］，能夠經常從腹瀉的人類［2］以及出血性敗血癥的魚類中分離到［3］。研究表明，嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌以及維氏氣單胞菌為3種主要的致病性氣單胞菌，涵蓋了氣單胞菌中85%的臨床病癥來源［4］。目前在水產動物養殖上，對于氣單胞菌致病性的研究主要為嗜水氣單胞菌［5］，對維氏氣單胞菌的致病性及分布關注并不多。團頭魴(MegalobramaamblycephalaYih)隸屬硬骨魚綱鯉形目鯉科鳊亞科，是我國重要的草食性經濟魚類之一，具有味美、生長快、抗病力強等特點，是江蘇省南部地區的主要淡水養殖品種。出血病是團頭魴養殖過程中危害最嚴重、造成經濟損失最大的病害，通常認為由嗜水氣單胞菌引起［6］，使用抗生素進行防治［7］。然而，隨著養殖密度的擴大、養殖水體的惡化以及抗生素的濫用，團頭魴出血病呈常發、難治的態勢。本研究在江蘇省常州市武進區某團頭魴養殖塘剛剛出現出血病后，即對該塘口的不同生態位進行細菌分離、鑒定及人工感染試驗，同時分析菌株的毒力基因及耐藥性，以期為團頭魴出血病的發病機理及分子流行病學研究提供基礎數據，為該病的防控提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1．1發病塘口及菌株

2010年7月11日常州武進某團頭魴池塘出現大批團頭魴死亡的情況。塘口檢查發現病魚游動緩慢，攝食減少，腸道內食糜少或無，體表腹部、尾鰭以及鰓部有出血點，部分有大面積的皮膚潰爛。解剖檢查發現一部分病魚肝臟發白、腫大，一部分有溶血性腹水。采集該池塘病魚21尾，利用選擇性培養基分離細菌，分離位點包括魚的腸道、體表黏液、鰓、腹腔、肝臟、腎臟等。同時采集該池塘的水樣、底泥，利用選擇性培養基分離水體、浮游生物和底泥中的細菌。

1．2主要試劑及培養基

細菌生化鑒定管、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，RS培養基［8］、LB培養基為本課題組配制。

1．3細菌的分離、篩選

病魚腸道、體表黏液、鰓、腹腔、肝臟、腎臟等位點用接種環劃線RS固體培養基;將池塘水經25μm的膜或者濾紙過濾后，水體位點的菌株用過濾后的水涂RS培養基;浮游生物位點則是將濾紙浸入無菌生理鹽水、振蕩后，劃線RS固體培養基;底泥經無菌生理鹽水稀釋后涂RS培養基。RS培養接種后，28℃培養24h。隨機挑選5個單菌落劃線接種LB固體平板。用氧化酶、接觸酶、O/F、鳥氨酸脫羧酶對單菌落作進一步篩選，鳥氨酸脫羧酶陽性為維氏氣單胞菌區別與其他氣單胞菌的主要生化特性［9］。對4個生化指標都為陽性的菌株接種LB液體，28℃培養24h后，用15%液體甘油－80℃保存備用。

1．4維氏氣單胞菌鑒定

1．4．1細菌DNA模板的制備

將保存在－80℃中的菌株，接種LB液體培養基，28℃培養18h，離心收集菌體，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA，作為DNA模板。

1．4．2維氏氣單胞菌管家基因測序與系統發育樹的構建

根據氣單胞菌16SrDNA和管家基因gyrB，通過構建系統發育樹鑒定細菌菌株。16SrDNA引物為AER－F(5'－CTACTTTTGCCGGCGAGCGG－3');AER－R(5'－TGATTCCCGAAGGCACTCCC－3')［10］由上海生工合成。反應條件:94℃變性2min;接著30個循環:94℃30s，58℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR產物，用1．2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照，片段大小953bp。有目的片段則判斷該菌株為氣單胞菌屬。管家基因gyrB擴增引物:gyrB－3F(5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT－3')和gyrB－14R(5'－TTGTCCGGGTTGTACTCGTC－3')［11］由上海生工合成。反應條件:94℃變性2min;接著30個循環:94℃30s，59℃30s，72℃90s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR產物，用1．2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統下拍照，片段大小為1100bp。PCR產物純化后送上海生工序列測序。系統發育樹的構建:將測序菌株的gyrB序列用Blast軟件與GenBank數據庫中相關的親近物種進行相似性分析，并用Mega4．1中的Neighbor－Joining法構建系統進化樹。

1．4．3維氏氣單胞菌的生化特性

將菌株接種生化培養管后，28℃培養24h，觀察并記錄結果。生化特性包括賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸轉氨酶、硝酸鹽(還原)、硫化氫、明膠、葡萄糖、乳糖、β－半乳糖苷(ONPG)、山梨醇、赤鮮醇、衛矛醇、丙二酸鹽等。

1．5維氏氣單胞菌的人工感染

對確定為維氏氣單胞菌的菌株進行人工感染試驗，驗證其致病性。具體方法為:將菌株單菌落接種LB液體培養基，28℃培養20h，將細菌濃度稀釋為109CUF/mL。每個菌株腹部肌肉注射5尾魚，魚體重(100±3)g，注射劑量為每100g魚體重0．5mL菌株。然后觀察魚的發病、死亡情況，統計24h、48h的死亡率，并對人工感染后具有典型癥狀的死魚進行拍照、解剖以及優勢菌的分離鑒定。

1．6維氏氣單胞菌毒力基因的檢測

用PCR檢測氣單胞菌的2種主要毒力基因。溶血素基因hly，片段大小597bp。引物為hly－F(5'－GGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG－3')和hly－R(5'GGCGGCGCCGGACGAGACGGG－3')［12］。反應條件:94℃變性3min，接著30個循環:92℃30s，65℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。細胞興奮性腸毒素基因alt，片段大小442bp。引物為alt－F(5'－TGACCCAGTCCTGGCACGGC－3')和alt－R(5'－GGTGATCGATCACCACCAGC－3')［13］。反應條件:94℃變性3min;接著30個循環:92℃30s，60℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。