陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病，以發(fā)作性血管內(nèi)溶血、靜脈血栓形成、骨髓造血功能衰竭為主要表現(xiàn)。近年來，PNH的發(fā)病率有增高趨勢(shì)，北方多于南方，半數(shù)以上發(fā)生在20～40歲，個(gè)別10歲以下及70歲以上，男性多于女性。我國(guó)患者多以貧血、出血、血紅蛋白尿?yàn)槭装l(fā)癥狀，合并血栓者少見。該病雖為良性克隆性疾病，但起病急驟，病情反復(fù)，遷延不愈，生存質(zhì)量差，存活期短。因此，深入研究其病理機(jī)制，探討新的治療思路是目前亟待解決的難題。

眾所周知，PNH是由于患者造血干細(xì)胞中PIG-A基因發(fā)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨合成障礙，從而使血細(xì)胞膜表面GPI錨連蛋白缺失，如CD55、CD59等，使細(xì)胞抵抗補(bǔ)體攻擊的能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞容易被破壞，發(fā)生溶血及全血細(xì)胞減少。但目前多種研究已顯示PIG-A基因突變本身并不能賦予PNH克隆增殖優(yōu)勢(shì)，PNH的發(fā)病還需其他因素參與。現(xiàn)就PNH病理機(jī)制介紹如下。

1PIG-A基因突變

PIG-A基因編碼484個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物———α1-6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)亞基，該酶參與GPI錨連蛋白的合成過程。PNH的PIG-A基因突變是異質(zhì)性的，突變位點(diǎn)各不相同。目前，已經(jīng)報(bào)道的PIG-A基因突變有100多種，隨機(jī)發(fā)生于整個(gè)編碼區(qū)，沒有突變叢集區(qū)或熱點(diǎn)，第2號(hào)外顯子是PIG-A基因中最大的一個(gè)外顯子，發(fā)生突變的頻率最高，大多數(shù)突變形式(約占2/3)為小的堿基插入或缺失，其中缺失更為常見。我們的課題組對(duì)PNH及再生障礙性貧血(AA)-PNH患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的PIG-A基因進(jìn)行突變形式檢測(cè)，結(jié)果示部分中國(guó)PNH患者的突變類型多表現(xiàn)為單個(gè)堿基置換，且發(fā)生部位均不相同(待發(fā)表)。該研究結(jié)果支持PIG-A基因突變的高發(fā)性和隨機(jī)性，PIG-A基因突變導(dǎo)致GPI錨連蛋白的減少或缺失，可能賦予PNH細(xì)胞一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，致PNH克隆擴(kuò)增。

然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PIG-A基因突變?cè)谡Ｈ搜?xì)胞中偶爾也可檢測(cè)到，但只有PNH患者體內(nèi)的PNH造血干細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，克隆性增殖，并最終導(dǎo)致了PNH發(fā)病。最近一些研究也提示，健康對(duì)照者中大多數(shù)PIG-A基因突變發(fā)生在集落形成細(xì)胞水平，而不是造血干細(xì)胞水平，因?yàn)榧湫纬杉?xì)胞沒有自我更新能力，所以在健康對(duì)照者中發(fā)現(xiàn)的PIG-A基因突變與PNH的病理生理無關(guān)聯(lián)或關(guān)聯(lián)性很低。因此，PNH克隆增殖是PNH發(fā)病的必要條件之一，PIG-A基因突變是PNH克隆增殖的前提，然而單純PIG-A基因突變并不足以致PNH克隆增殖。PNH克隆增殖優(yōu)勢(shì)一定還依賴于除PIG-A基因突變之外的其他機(jī)制參與。

2免疫逃避機(jī)制

最近的研究表明，單純PIG-A基因突變并不導(dǎo)致PNH克隆先天生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。那么，究竟是何種因素導(dǎo)致PNH干細(xì)胞克隆性增殖，從而導(dǎo)致PNH發(fā)病?近年來，有學(xué)者提出假設(shè):PNH患者體內(nèi)存在由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，使自身免疫系統(tǒng)選擇性地攻擊正常造血干細(xì)胞，而PNH克隆因缺乏GPI錨連蛋白可逃避該免疫攻擊，從而獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。兩因素協(xié)同作用才導(dǎo)致PNH發(fā)病，這也被稱為PNH的雙因素發(fā)病學(xué)說。這一假說得到了直接和間接的證據(jù)。(1)直接證據(jù):Risitano等研究了PNH患者的T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)3(TCR-VβCDR3)的序列，發(fā)現(xiàn)PNH患者的TCR-VβCDR3與正常人不同，呈偏態(tài)非高斯分布，以CD8+T淋巴細(xì)胞為甚。基于TCR-VβCDR3可鑒別不同克隆T細(xì)胞群的理論，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該T細(xì)胞群為寡克隆，且其中可能含有異常增殖的T細(xì)胞克隆。Mer-chav等將1例PNH患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，去除T淋巴細(xì)胞后，其集落的產(chǎn)率較不去除明顯增加(4.5倍)，與正常對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)體系中加入甾體類藥物后，T淋巴細(xì)胞對(duì)集落形成的抑制作用明顯減弱。這些實(shí)驗(yàn)提示T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制參與了PNH的發(fā)病。(2)間接證據(jù):曾先后有使用抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(ATG)治療PNH部分有效的報(bào)道，從另一側(cè)面證實(shí)了PNH的發(fā)病機(jī)制中有T細(xì)胞免疫的參與。

PNH患者體內(nèi)存在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，那么，PNH患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞本身是否存在異常?國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了研究，均已證實(shí)PNH患者體內(nèi)存在PNH克隆型的T淋巴細(xì)胞，且存在CD3+CD4+/CD3+CD8+細(xì)胞比例倒置、T淋巴細(xì)胞基因的異常、T淋巴細(xì)胞表面免疫抑制性受體超家族的表達(dá)存在異常、T淋巴細(xì)胞功能的異常。

本課題組在國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)上也進(jìn)行了較為深入的研究:(1)PNH患者CD4+T淋巴細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯下降，CD8+T淋巴細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯升高，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例倒置，Th1細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯升高，這些變化均以AA-PNH患者更為明顯，且與患者血象及骨髓增生情況呈負(fù)相關(guān)。提示PNH患者T淋巴功能亢進(jìn)，細(xì)胞免疫向Th1方向極化，淋巴因子的分泌失調(diào)，可產(chǎn)生過量的造血負(fù)調(diào)控因子，如白介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，從而表現(xiàn)出明顯的造血抑制活性，導(dǎo)致PNH患者造血功能受抑，骨髓衰竭。(2)探討了GPI－T淋巴細(xì)胞和GPI+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，結(jié)果顯示PNH患者體內(nèi)存在一定數(shù)量的GPI－T淋巴細(xì)胞，其占T淋巴細(xì)胞的比例明顯低于PNH克隆占粒系、紅系、單核系的比例;其更易出現(xiàn)在AA-PNH患者體內(nèi);其占CD8+T淋巴細(xì)胞的比例高于占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例;其CD69的表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照，與GPI+T淋巴細(xì)胞CD69的表達(dá)率相似，與患者血象及骨髓增生程度負(fù)相關(guān)。提示患者GPI+、GPI－T淋巴細(xì)胞功能均升高，細(xì)胞免疫亢進(jìn)，這種亢進(jìn)破壞了患者的造血功能，但與T淋巴細(xì)胞的來源無關(guān)。

3二次基因突變

PIG-A基因突變和免疫機(jī)制介導(dǎo)的骨髓損傷對(duì)PNH克隆擴(kuò)增是必需的，但僅有二者并不足以致PNH發(fā)病。PNH克隆在體內(nèi)獲得生存及增殖優(yōu)勢(shì)可能與二次基因突變有關(guān)。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)主要有HMGA2基因突變、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因突變、抗凋亡基因(EGR-1基因、TAXREB107基因)、WT1基因及HLA-DR的表達(dá)異常與PNH克隆的增殖優(yōu)勢(shì)相關(guān)。

人類HMGA2基因位于12號(hào)染色體的q15區(qū)，又稱構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)大量靶基因的轉(zhuǎn)錄，該基因在胚胎發(fā)生過程中高表達(dá)，正常成熟組織中無表達(dá)或微量表達(dá)。HMGA2還啟動(dòng)間質(zhì)腫瘤的形成，人類良性間質(zhì)腫瘤中最常見。HMGA2可通過負(fù)性調(diào)節(jié)ERCC1啟動(dòng)子抑制核苷酸的切除修復(fù)途徑，抑制DNA損傷的修復(fù)，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定。該基因被認(rèn)為是發(fā)生染色體重排的高頻靶點(diǎn)之一。PNH克隆屬骨髓造血干細(xì)胞的非腫瘤性增殖，上述研究結(jié)果說明HMGA2基因的異位表達(dá)和PIG-A基因突變共同參與了PNH克隆增殖，即PNH患者可能存在二次基因突變現(xiàn)象。

HPRT基因定位于X染色體q26～27區(qū)域，編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，參與體內(nèi)嘌呤核甘酸的補(bǔ)救合成途徑，此酶的特異性不強(qiáng)，可將嘌呤類似物6-巰代鳥嘌呤(6-TG)摻入到DNA中而引起細(xì)胞死亡。目前應(yīng)用抗6-TG方法檢測(cè)體細(xì)胞HPRT基因突變，如果培養(yǎng)體系中含有6-TG，在HPRT作用下，6-TG能摻入到新合成的DNA中，阻止DNA半保留復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡;而HPRT基因突變的細(xì)胞由于不能編碼生成HPRT，不影響DNA復(fù)制，細(xì)胞仍能存活。

EGR-1基因介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化及多能造血干細(xì)胞的自我更新。WT1基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，可以激活或者抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與多種細(xì)胞包括造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及凋亡過程。既往有研究顯示，PNH患者EGR-1基因及WT1基因較正常人呈現(xiàn)高表達(dá)水平，且PNH患者WT1基因在BMMNCs的表達(dá)與粒系CD16b表達(dá)比例呈正相關(guān)，說明EGR-1基因和WT1基因mRNA表達(dá)水平與PNH克隆有關(guān)，PNH克隆的擴(kuò)增需要除外PIG-A基因突變之外的其他基因缺陷的參與。本課題組利用流式細(xì)胞分選技術(shù)將PNH患者的CD59－細(xì)胞分選出來，檢測(cè)其EGR-1基因和WT1基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示PNH患者GPI缺陷細(xì)胞(CD59－細(xì)胞)EGR-1基因和WT1基因mRNA的表達(dá)水平均顯著高于同一PNH患者的CD59+細(xì)胞及正常對(duì)照組，且上述兩種基因的相對(duì)表達(dá)量與CD59－細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，即EGR-1基因和WT1基因的表達(dá)與PNH克隆增殖相關(guān)(待發(fā)表)。由此證實(shí)除PIG-A基因突變之外，PNH患者EGR-1基因及WT1基因的過度表達(dá)對(duì)PNH克隆取得增殖優(yōu)勢(shì)可能起到促進(jìn)作用。

核糖體蛋白L6(RPL6)又稱Taxreb107，是HTLV-1原癌蛋白Tax應(yīng)答序列結(jié)合蛋白，Tax是人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒編碼的轉(zhuǎn)錄因子，Taxreb107/RpL6可能通過與Tax的相互作用而調(diào)節(jié)Tax在病毒感染中的作用。目前關(guān)于Taxreb107基因的功能還未完全闡明，已明確的是其在促紅細(xì)胞生成過程的正調(diào)控作用。有研究7例PNH中，3例TAXReb107基因呈現(xiàn)過度表達(dá)，提示TAXReb107作為一種抗凋亡基因，可能參與了PNHGPI－細(xì)胞的凋亡、分化與增殖過程，但由于所研究樣本例數(shù)有限，具體機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。

4抗凋亡機(jī)制

凋亡機(jī)制在PNH克隆增殖中的作用也是PNH發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。目前，關(guān)于PNH克隆是否具有抗凋亡優(yōu)勢(shì)還存在分歧。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外無Fas抗體及配體誘導(dǎo)的條件下培養(yǎng)，PNH患者粒細(xì)胞的凋亡率明顯低于正常對(duì)照者，且PNH克隆也具有抵抗TNF-α和IFN-γ等的凋亡誘導(dǎo)作用。

Chen等通過將分選后的PNH患者GPI+CD34+細(xì)胞和GPI－CD34+細(xì)胞及正常對(duì)照組CD34+細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后測(cè)定其凋亡率和Fas的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PNH患者GPI+CD34+細(xì)胞的凋亡率和Fas的表達(dá)明顯高于GPI－CD34+細(xì)胞，而PNH患者GPI－CD34+細(xì)胞與正常對(duì)照組CD34+細(xì)胞都為相似的低水平凋亡率。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PNH克隆的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)可能是由于PNH患者的GPI+CD34+細(xì)胞對(duì)凋亡高度敏感而產(chǎn)生機(jī)體對(duì)PNH克隆的選擇。最近又有研究發(fā)現(xiàn)一些抗凋亡基因(humanA1、Hhr23B、Mcl-1、RhoA)在PNH患者有顯著的高表達(dá)，但這些基因是否降低PNH克隆的凋亡率，目前尚無相關(guān)研究。

綜上所述，PIG-A基因突變導(dǎo)致GPI－錨連蛋白缺失而引起的血管內(nèi)溶血機(jī)制已十分明了，但何種機(jī)制導(dǎo)致PNH克隆的增殖優(yōu)勢(shì)目前仍未闡明。目前為止，PNH尚無有效治療方法，新近報(bào)道的單克隆抗體eculizumab通過抑制補(bǔ)體終末階段的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，可有效控制PNH的溶血及其其他癥狀，但此抗體從根本上保護(hù)了PNH克隆的形成，并不能根治PNH。通過對(duì)PNH克隆增殖發(fā)病機(jī)制的深入研究，可能會(huì)探索到減弱PNH患者體內(nèi)的PNH克隆的有效治療方法。