陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性造血干細胞基因突變的克隆性疾病，即PNH患者造血干細胞中染色體Xp22.1上PIG-A基因發(fā)生突變，導致部分或完全血細胞膜糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨合成障礙，造成血細胞表面錨連蛋白缺失，使細胞抵抗補體攻擊的能力減弱，從而導致細胞容易被破壞，發(fā)生溶血。臨床主要表現(xiàn)為不同程度的骨髓造血功能衰竭、靜脈血栓形成和發(fā)作性血管內(nèi)溶血。PNH患者異?？寺∨c正常造血并存，使本病的發(fā)病機制研究和診斷受到很大限制。經(jīng)典的診斷方法已不能滿足臨床所需，代之以流式細胞術為代表的現(xiàn)代檢測手段。以腎上腺糖皮質激素為代表的傳統(tǒng)治療手段仍然是初發(fā)PNH的一線治療選擇，但對臨床上大多數(shù)難治和復發(fā)患者無效。近年來重組人源型抗補體C5單克隆抗體及化療、干細胞移植、基因治療在PNH領域的應用取得了一定進展。

1診斷進展

1.1傳統(tǒng)診斷

1.1.1血管內(nèi)溶血證據(jù)

血紅蛋白尿、血游離血紅蛋白增高及結合珠蛋白降低、血清乳酸脫氫酶升高、血清pH值減低;尿潛血和尿含鐵血黃素染色(Rous試驗)可視為過篩試驗，其中Rous試驗敏感率可達73%，是診斷慢性血管內(nèi)溶血的重要指標。

1.1.2骨髓紅系造血代償證據(jù)

外周血網(wǎng)織紅細胞增高、骨髓涂片和活檢可見紅系造血代償性增生。

1.1.3特異性補體溶血試驗

常用的有Ham's試驗，敏感度較低，但特異度高，此實驗是否陽性取決于PNH患者對補體敏感的異常細胞數(shù)量，結果易受輸血的影響;糖水試驗敏感度高但特異度差，易出現(xiàn)假陽性;蛇毒因子溶血試驗敏感度為80%。微量補體溶血敏感試驗可以檢測紅細胞破溶所需補體量，借此將PNH紅細胞分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型?？傊鲜鰧嶒灥拿舾卸群吞禺惗染桓撸阎饾u被現(xiàn)代診斷手段所代替。

1.2現(xiàn)代診斷

1.2.1PNH異?？寺〉暮Y選和識別

1.2.1.1流式細胞術直接檢測外周血和骨髓血細胞GPI錨連蛋白

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20余種蛋白在PNH患者血細胞表面表達缺乏，如衰變加速因子(DAF，CD55)、反應性溶血膜抑制物(MIRL，CD59)、C8結合蛋白(HRF)、內(nèi)毒素受體(CD14)、低親和力Fc受體(CD16)及尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(uPAR，CD87)等。應用流式細胞術檢測GPI錨連蛋白缺失細胞數(shù)量是診斷PNH最直接、最敏感的方法。PNH克隆累及造血細胞次序為粒細胞、單核細胞、紅細胞、淋巴細胞，骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)織紅細胞略早于紅細胞。建立PNH診斷至少有一系及以上細胞的2種GPI錨連蛋白缺失。CD59敏感度要高于CD55，CD59－粒細胞可最早被檢出，有早期診斷價值，且不受輸血影響。CD55和CD59同時部分或完全缺失是PNH的典型表現(xiàn)。對PNH克隆錨連蛋白的不同缺失程度進行量化，可以對PNH進行分型，以便進一步了解并監(jiān)測病情進展及療效。例如將PNH紅細胞根據(jù)CD55、CD59的缺乏程度可以分為三型:Ⅰ型(補體敏感度正常)、Ⅱ型(中度敏感)、Ⅲ型(高度敏感)，臨床溶血程度主要取決于Ⅲ型紅細胞的多少。外周血和骨髓均可以作PNH克隆分析，要求受檢者提供近期輸血記錄，并對紅細胞和粒細胞都做篩查。如果患者在檢測前有多次輸血或重度溶血，那么PNH篩查可能受到輸血的影響，導致錯誤結果;少數(shù)患者(5%)嚴重溶血后，GPI缺乏的紅細胞可能會減少，甚至可能下降到檢測限以下，因此只能檢測到粒細胞PNH克隆?；颊呷绻袊乐氐脑偕系K性貧血(AA)，可能導致粒細胞數(shù)量減低，不足以檢測分析。由于PNH的異常細胞起源于造血干細胞，當外周血尚無CD59－細胞時，骨髓中可能已經(jīng)有CD59－細胞。因此，從疾病的早期診斷的角度考慮，骨髓中CD55－、CD59－檢測比外周血更有意義。且骨髓中的有核紅細胞不受輸血和溶血的影響，可避免出現(xiàn)漏診。故建議貧血性疾病早期診斷應作骨髓有核紅細胞、粒細胞和單核細胞的CD55、CD59檢查，能有效提高PNH診斷的特異度和敏感度。此外，近年來有學者力圖尋找診斷PNH更敏感的標志物，如使用流式細胞術檢測網(wǎng)織紅細胞、粒細胞及單核細胞上錨連蛋白CD58和CD59、CD24/66b及CD14的表達等［1］。

1.2.1.2熒光標記氣單胞菌溶素前體變異體(FLAER)

近年國內(nèi)外有應用FLAER技術輔助診斷PNH。Diep等［2］報道嗜水氣單胞菌(HEC)毒素能特異地與細胞膜上GPI錨連蛋白結合，隨后立即聚合成多聚體，插入細胞膜的脂質雙層，在膜上形成孔洞使細胞滲透壓改變而溶破。PNH細胞則由于缺乏GPI蛋白使其具抵抗毒素作用而最終保持細胞完好，毒素作用后細胞留存率與CD59－率一致。經(jīng)過工藝的改進，形成FLAER技術，F(xiàn)LAER是Alexa-488標記的無活性氣單胞菌溶素前體的變異體，它同野生型前氣單胞菌溶素相似，可特異地結合于GPI錨連蛋白，但并不形成細胞通道，不引起細胞的溶血，因此不會導致細胞死亡。該標記類似于熒光素，可在一定條件下被激發(fā)出熒光，可以通過流式細胞儀進行檢測，并區(qū)分GPI－和GPI+細胞。FLAER作用于所有GPI蛋白，不會因細胞表達GPI蛋白種類和多少的不同造成誤差。因此，F(xiàn)LAER是診斷PNH更敏感、特異的方法。同傳統(tǒng)的檢測CD55、CD59相比，F(xiàn)LAER對檢測微小PNH克隆非常敏感，且不受輸血和溶血的影響，比CD55、CD59檢測更清晰、準確、直觀，對一些臨床上高度懷疑，而CD55、CD59檢測不能確診的病例，可以結合FLAER檢查，獲得明確診斷;應用FLAER分析方法診斷并監(jiān)測PNH患者，可精確分出Ⅱ、Ⅲ型細胞，為判斷病情輕重提供依據(jù)，有助于PNH患者疾病進展和療效的判斷;對于長期應用免疫抑制治療的血細胞減少患者，尤其是AA、骨髓增生異常綜合征(MDS)等疾病，可監(jiān)測其是否發(fā)生克隆性改變以及早發(fā)現(xiàn)病情變化;應用FLAER直接檢測GPI蛋白，有助于真正的PNH和部分免疫性血細胞減少癥患者的鑒別，明確真正的GPI－細胞［3－4］，而非自身抗體覆蓋細胞膜錨連蛋白的假性PNH克隆，即可用于“真、假”PNH的鑒別。

1.2.2PIG-A基因突變檢測

PNH是造血干細胞PIG-A基因突變致合成GPI錨所需的1-6-N乙酰氨基葡糖轉移酶缺陷，從而使血細胞膜表面GPI錨連蛋白缺失，血細胞對激活補體的敏感性增加而被破壞。PNH的PIG-A基因突變是異質性的，突變位點各不相同。目前，已經(jīng)報道的PIG-A基因突變有100多種，隨機發(fā)生于整個編碼區(qū)，沒有突變叢集區(qū)或熱點［5］。PIG-A基因突變是最特異的診斷PNH的方法，但由于技術問題，目前僅限于研究，尚未用于常規(guī)診斷。

2治療進展

2.1傳統(tǒng)治療

PNH的傳統(tǒng)治療手段仍然是以“保護”PNH克隆，減少補體的攻擊和破壞，減輕溶血為目的，并不能根除PNH克隆。目前仍然是以腎上腺糖皮質激素(潑尼松每日0.25～1.00mg/kg)為主，輔以細胞膜穩(wěn)定劑(維生素E)及抗凝治療，對多數(shù)初診患者能減輕溶血發(fā)作、穩(wěn)定病情。若為AA-PNH綜合征可輔助雄激素、免疫抑制劑等治療。

2.2現(xiàn)代治療

2.2.1聯(lián)合化療

臨床上大多數(shù)PNH患者經(jīng)過一段時間的治療后會出現(xiàn)激素無效或依賴，即所謂“難治或復發(fā)”，此類患者的治療是棘手的難題。即如何有效地減少PNH異常克隆，最大限度地控制溶血，又盡可能地減少激素用量，防止激素的不良反應是亟待解決的問題。本課題組［6－7］受到白血病化療的啟發(fā)，既然PNH也是一種克隆性疾病，即PNH患者體內(nèi)正常克隆與異?？寺〔⒋?，因此我們試驗性地采用化療，利用正?？寺≥^PNH克隆耐受補體能力強、對造血生長因子反應好、正常造血恢復快的優(yōu)勢，使正?？寺≈鸩饺〈鶳NH克隆而達到治療目的。我們采用DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)方案對部分難治、復發(fā)性或對激素依賴、無法減量而出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥的患者進行化療，結果顯示，8例中PNH克隆明顯減少的有5例;6例溶血指標明顯好轉;8例外周血細胞減少者經(jīng)血常規(guī)檢驗均有明顯進步，6例已脫離輸血;所有患者腎上腺糖皮質激素的用量較化療前減少一半以上，有1例已經(jīng)脫離激素治療。在骨髓抑制期，部分患者出現(xiàn)呼吸道或肛周感染、皮膚皰疹，經(jīng)抗生素及抗病毒治療感染均得以控制;肝、腎等重要器官功能無明顯改變;所有患者無嚴重、致命的并發(fā)癥發(fā)生。提示化療能夠有效地減少PNH克隆負荷，控制溶血，改善貧血，而且大大減少了激素的用量，是一種較有應用前景的治療手段。但為避免出現(xiàn)化療后骨髓抑制期的嚴重并發(fā)癥(貧血、出血和嚴重感染)，化療采用的劑量應偏小，療程亦應適當，一旦出現(xiàn)并發(fā)癥，應給予積極治療。

2.2.2重組人源型抗補體蛋白C5單克隆抗體(Eeulizumab，Soliris)

PNH是由于補體在紅細胞外激活形成C5b-7，然后結合到紅細胞膜上再與C8及C9作用形成C5b-9(即膜攻擊復合體)，由于紅細胞表面缺乏某些錨連蛋白，如C3轉化酶衰變加速因子(DAF)(可阻止C3轉化酶的形成)，因而大量C3轉化為C3b進而形成C5b，以致C5b-9破壞紅細胞膜導致溶血。Eeulizumab能特異性地結合到人末端補體蛋白C5，通過抑制人補體C5向C5a和C5b的裂解，以阻斷炎癥因子C5a的釋放及5b-9的形成。

研究表明該抗體對C5有高度親和力，能阻斷C5a和C5b-9的形成，并保護哺乳動物細胞不受C5b-9介導的損傷。由于該單抗抑制機體的免疫系統(tǒng)功能，從而增加了患者對某些嚴重感染的易感性，據(jù)統(tǒng)計服藥期間易出現(xiàn)細菌性腦膜炎。臨床試驗證實Eeulizumab治療PNH可顯著減輕血管內(nèi)溶血，減少紅細胞輸注，明顯改善PNH患者貧血，減少血栓形成，延長生存期。該藥安全，耐受性良好，無明顯不良反應發(fā)生［8］。Eeulizumab于2007－03－16被美國FDA批準用于治療PNH，推薦劑量600mg，使用4周，第5周900mg，以后每2周900mg，可成功控制補體依賴性溶血。

2.2.3骨髓移植(BMT)根治

PNH在于消除異常造血干(祖)細胞，重建正常造血功能，目前認為BMT是惟一可能治愈本病的方法。BMT治療一般僅限于難治性、耐腎上腺皮質激素或有激素禁忌證的PNH患者，適應證為(1)合并骨髓衰竭;(2)難治性PNH，輸血依賴性溶血性貧血;(3)反復出現(xiàn)危及生命的血栓栓塞事件;(4)小于20歲的患者［9］。

2.2.4基因治療

有研究顯示，用反轉錄病毒載體將編碼一種跨膜CD59的基因轉入PNH克隆，使得CD59得以表達，可減輕細胞對補體的敏感性，減輕溶血。此外，Nishimura等［10］以反轉錄病毒為載體，將含正常PIG-A基因有效并穩(wěn)定地轉入PNH患者的異常細胞株內(nèi)，可使其恢復GPI連接蛋白的表達。

總之，目前有關PNH的基因治療尚處于初期試驗階段，只有深入研究PIG-A基因的突變規(guī)律及PNH的發(fā)病機制才能有望PNH的基因治療有所突破。綜上所述，經(jīng)典的補體溶血試驗診斷PNH缺乏敏感度和特異度，流式細胞術和分子生物學手段的應用，使PNH的診斷取得了突破性進展;以腎上腺糖皮質激素為代表的傳統(tǒng)治療手段對部分初發(fā)PNH可取得一定療效;重組人源型抗補體C5單克隆抗體、化療、干細胞移植和基因治療給激素無效或激素依賴的難治性或復發(fā)性PNH患者帶來了希望。