MSCs治療優勢及其應用

1966年Friedenstein等［2］首先從骨髓中發現MSCs，是來源于中胚層的成體干細胞，廣泛存在于全身結締組織和器官間質中。MSCs在體外長期培養的過程中始終保持多向分化潛能，而且易于分離、培養、擴增及外源基因的導入和表達，免疫原性弱，具有強大的遷移能力。其分泌的多種細胞因子具有調節免疫、支持造血的特性，對于修復組織缺陷或損傷有獨特的優勢，遺傳背景穩定，且不受胚胎干細胞研究中遇到的倫理問題限制。因此，MSCs在細胞治療、基因治療及組織工程中得到廣泛的應用。目前研究較多的是骨髓MSCs、外周血MSCs、臍帶MSCs、胎盤MSCs及羊水MSCs。骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓微環境中的一種成體干細胞，來源于發育早期的中胚層，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。動物實驗及臨床研究證實，BMSCs可促進損傷組織結構及功能的修復，用于治療腦、脊髓、心肌、皮膚及頜面部等多種損傷性疾病，臨床已取得滿意療效［3－5］。但成人BMSCs存在病毒高度污染的可能和潛在的致瘤性，隨著年齡增長其細胞數量和擴增、分化能力呈明顯下降趨勢，且供者BMSCs采集須行骨髓穿刺術，因患者易感染、體質較弱等因素限制了自體BMSCs移植的應用。近年來，自體外周血干細胞(peripheralbloodstemcells，PBSC)移植已成為繼自體骨髓移植之后治療惡性血液病、免疫缺陷性疾病和某些實體腫瘤的又一有效輔助方法，在治療神經、心血管系統疾病等方面也取得滿意療效。PBSC具有更強的增殖能力、造血及免疫功能恢復快、來源及采集方便及痛苦小等優點。但外周血的祖細胞和多能造血干細胞只占骨髓細胞的1/104～1/105，需用血細胞分離器采集多次，同時需借助造血干細胞動員劑，使骨髓或其它部位的造血干細胞進入血流，以提高外周血造血干細胞的單次采集效果。

臍帶間充質干細胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UCMSCs)的研究是傳統BMSCs的新生力量，UCMSCs多數生物學特征與BMSCs相似，但其增殖能力、CFU-F頻率、CD106、HLA-Ⅰ表達和神經誘導分化能力等優于BMSCs。同時臍帶來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，不影響臍帶造血干細胞的保存，無道德倫理限制［6］，且其干細胞輸注相關的病毒和病原微生物感染率遠低于BMSCs移植，是一類免疫缺陷細胞，不需經過嚴格配對，異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，適于不同個體之間移植且易于轉染外源基因。目前已用于治療神經退行性疾病帕金森綜合癥、肺纖維化修復、類風濕、腎損傷、大腸炎、改善肝硬化后肝功能、抑制乳腺癌等領域以及作為基因治療載體細胞［7－10］。因此，作為一種新型種子細胞，UCMSCs的應用具有更廣闊的前景。另外，目前發現通過各種體外誘導方法，可使胎盤間充質干細胞(placentalmesenchymalstemcells，PMSCs)可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞等多種細胞［11］。PMSCs來源廣泛，供者無痛苦，污染機會少，分化能力較佳，增殖迅速，具有更強的長期增殖能力。Prusa等［12］首次證實，羊水細胞表達Oct-4轉錄因子，Oct-4被認為是鑒定多潛能干細胞的標志性基因。羊水來源干細胞同樣具有多向分化潛能，培養條件適當可以分化出內胚層、中胚層、以及外胚層3個胚層的細胞［13］。近年羊水干細胞在組織工程學領域的研究有了新的突破，包括成功地構建了組織工程骨［14］、人工心瓣膜的體外培育［15］及異體移植后聯合高壓氧療促進受損神經生長［16］等多個方面。羊水取材簡便，既可在產前診斷時經羊膜穿刺獲取，也可在分娩過程中收集。不會對母親和胎兒造成傷害，安全性高，且不涉及倫理問題。

MSCs治療卵巢早衰

近年來采用骨髓、臍帶和羊水來源MSCs移植治療化療藥物、免疫性卵巢炎、半乳糖和化學因子誘導的POF取得了明顯效果。MSCs原位、腹腔或靜脈注射后，可遷移、定植于卵巢，并在卵巢存活、生長，可恢復實驗動物卵巢形態、大小和正常動情周期，增加卵巢各級卵泡數，促進顆粒細胞生長，抗顆粒細胞凋亡，改善卵巢內分泌功能，恢復受孕。

1體外研究

體外研究分析干細胞治療作用的機理，目前主要研究干細胞與卵巢顆粒細胞共培養，檢測其是否可抑制卵巢顆粒細胞調亡。POF主要的病理學表現為顆粒細胞凋亡，而凋亡調控涉及多種基因和蛋白，包括Bcl-2基因(B-celllymphoma/leu-demia-2，淋巴細胞瘤/白血病基因-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、細胞型Flice抑制蛋白(cellular-Flicelikeinhibitoryprotein，cFLIP)、P53等［17－18］。Bcl-2可以通過線粒體途徑抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，而Bax則可促進細胞的凋亡。cFLIP在健康卵泡中高表達而在閉鎖卵泡中低表達，推測其具有抑制卵巢顆粒細胞凋亡作用［18］。一些細胞因子如血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)、肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)等也參與了凋亡調控過程［19－20］。體外培養BMSCs發現，其分泌的多種細胞因子如VEGF、HGF、IGF-1、堿性成纖維細胞生長因子(basicfi-broblastgrowthfactor，b-FGF)等，可減少細胞凋亡，促進上皮增生及血管生成，抑制炎癥反應［21－22］。付霞霏等［23］研究報道，顆粒細胞與BMSCs共培養后，BMSCs能上調Bcl-2基因在顆粒細胞中的表達，并分泌具有抗凋亡作用和促血管生成的細胞因子，如VEGF，IGF-1和HGF，顆粒細胞凋亡率下降，細胞存活率上升，BMSCs細胞數越多，凋亡率越低，呈現數量依賴性。陳芳等［24］在體外實驗發現，UCMSCs具有抑制卵巢顆粒細胞凋亡的作用。

2動物實驗及體內研究

由于POF的病因尚不清楚，目前仍沒有非常理想的POF動物模型。因化療藥物造模具有動物取材容易、病理結果與人一致、可用藥物逆轉、操作容易且造模投入人力和時間相對較少等優點，是目前常見卵巢早衰造模模型。目前研究主要針對化療藥物造模方式導致的卵巢早衰，觀察移植干細胞的存活遷移情況，探討MSCs移植對卵巢損傷大鼠卵巢結構、功能的影響及其可能作用機制，為進一步的研究和臨床治療提供實驗依據。Lee等［25］報道，移植綠色熒光標記的BMSCs至環磷酰胺誘導的POF小鼠體內，發現小鼠卵巢內未成熟卵泡數量顯著提高，且其遠期生殖能力也有所改善。隨后研究［23］發現，大鼠BMSCs的卵巢局部移植對化療所致的卵巢早衰有明顯的治療作用，表現為大鼠卵巢各級卵泡數增加，E2濃度明顯上升，FSH濃度明顯下降，表明BMSCs能修復卵巢結構，改善卵巢內分泌功能。其機制可能與BMSCs能分泌VEGF、IGF-1、HGF等，抑制卵巢顆粒細胞凋亡有關。賀衛衛等［26］也證實，BMSCs可促進損傷卵巢功能修復，其機制可能是BMSCs通過腹腔血管進入血液循環到達受損傷卵巢，利用其多向分化潛能分化發育成受損傷的組織。BMSCs中可能還存在生殖干細胞，分化發育成各級卵泡及BMSCs可分泌多種細胞外基質，促進損傷卵巢功能的修復。另有研究［27－28］發現，BMSCs在體內能選擇性地遷移和停留在機體受損傷的組織，可能與MSCs表面表達的生長因子、細胞因子和細胞外基質受體有關，這些因子驅使移植的BMSCs遷移至炎癥部位。隨著BMSCs移植時間的推移，免疫損傷卵巢的各級卵母細胞逐漸增多，BMSCs移植4周后，卵巢各部分細胞形態均與正常卵巢相似;而且凋亡的顆粒細胞數明顯減少，表明BMSCs對卵巢免疫損傷的修復有效。2010年埃及國家研究中心在德國舉行的世界生殖和不孕大會報告上報道，BMSCs使生育能力有缺陷的雌性實驗鼠的卵巢功能得到康復。最近一項研究用卵泡刺激素受體(FSHreceptor，FSHR)基因敲除的雌性小鼠模型來研究人類POF［29］，靜脈注射BMSCs后發現，小鼠成熟卵泡數及總卵泡數明顯增加，與對照組相比，血清FSH下降，雌激素增加，并在移植骨髓干細胞的小鼠卵巢內檢測到FSHRmRNA，表明BMSCs可到達小鼠卵巢，并刺激卵巢分化和表達FSHR基因，使FSHR對FSH產生反應，恢復卵泡的成熟發育和類固醇激素的生成，這為臨床上有生育要求的POF患者恢復受孕提供了可能。李彩霞等［30］研究UCMSCs發現，其表達OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系特異性標記物，且將其移植到POF小鼠體內后，具有向卵巢歸巢的能力，并能在局部存活生長，提示UCMSCs可能具有向生殖細胞轉化的潛能及卵巢損傷修復的作用。冷少華等［31］報道UCMSCs移植到動物體內后，能富集在卵巢早衰動物卵巢的卵泡周圍，非閉鎖始基卵泡數量顯著提高，表明UCMSCs具有向生殖細胞分化的能力。朱少芳等［32］通過鼠尾靜脈移植人UCMSCs到卵巢早衰的大鼠模型，發現體外標記PKH26的人UCMSCs可遷移至卵巢，主要沿基質血管分布，為追蹤人UCMSCs移植后在體內生長、分化和轉歸提供依據。李潔等［33］通過移植人羊水來源干細胞(AFS)治療大鼠卵巢早衰發現，AFS能有效地恢復動物的動情周期，提高體內雌激素分泌水平，改善卵巢組織卵巢早衰的狀況，并且分階段移植AFS比一次性移植AFS治療效果更顯著。綜上所述，MSCs移植修復損傷卵巢組織的機制可能為:(1)MSCs移植后，在特定的微環境誘導下可分化為受損組織的細胞，部分補償或替代其功能;(2)MSCs能分泌多種細胞因子，例如VEGF，HGF，IGF-I，TGF-β和GM-CSF等，通過旁分泌途徑參與顆粒細胞生長和凋亡調節過程。在體外和體內都能抑制靶細胞凋亡，修復受損組織細胞。(3)MSCs分化成卵巢組織細胞后，可能分泌激素，調控體內激素水平。(4)MSCs中可能還存在有生殖干細胞，分化發育成各級卵泡，促進損傷卵巢功能的修復，MSCs可分泌多種細胞外基質，也有助于損傷卵巢的恢復。

總結與展望

近年來卵巢早衰的發病率逐年增高，在女性因素不孕患者中所占的比例亦有逐年上升的趨勢，是婦科內分泌領域的常見疾病。MSCs作為組織損傷修復治療的一種新方法，為臨床治療POF提供了新思路。MSCs在體外長期培養的過程中始終保持多向分化的潛能，而且易于分離、培養、擴增及外源基因導入和表達，具有強大的遷移能力，分泌的多種細胞因子具有調節免疫、支持造血的特性，免疫原性低，遺傳背景相當穩定并且不受胚胎干細胞研究中遇到的倫理問題。MSCs的生物學特性及臨床應用已經在多種疾病中得到應用，修復損傷組織可通過各種機制發揮作用，如分化、遷移、歸巢、免疫調節及營養等。近年來采用骨髓、臍帶和羊水來源MSCs移植治療化療藥物、免疫性卵巢炎、半乳糖和化學因子誘導的卵巢早衰取得了明顯效果，MSCs直接或靜脈注射后，可遷移、定植于卵巢，并在卵巢存活、生長、可恢復實驗動物卵巢形態、大小和正常動情周期，增加卵巢各級卵泡數，促進顆粒細胞生長，抗顆粒細胞凋亡，改善卵巢內分泌功能，恢復受孕。利用MSCs移植可能改善卵巢早衰患者臨床癥狀及增加受孕幾率。

綜上，已有臨床前研究顯示，MSCs對卵巢早衰具有一定治療作用，但缺乏系統、完善的大樣本臨床前研究證實其安全性和有效性，而且目前國內研究局限于初步的動物實驗。各種MSCs抑制顆粒細胞凋亡和干細胞在動物體內遷移分布等方面的機制尚需進一步完善;MSCs向生殖細胞分化的潛能、細胞最佳移植方式、移植部位與數量、移植時間窗、移植后干細胞在體內的歸巢、轉歸及對卵巢損傷修復的作用評價指標等均需要進一步的探索研究。MSCs有望徹底治愈POF，也開拓了化療后POF治療的新方向，具有可觀的臨床應用前景。（本文作者：李惠敏、李海波、李紅 單位：南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心）